ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2009, том 426, № 4, с. 556-558
= ФИЗИОЛОГИЯ =
УДК 57.053+577.124.8
ВЛИЯНИЕ ГИПЕРГЛИКЕМИИ НА ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ КЛЕТОК ЭНДОТЕЛИЯ ВЕНЫ ПУПОВИНЫ ЧЕЛОВЕКА IN VITRO
© 2009 г. Н. И. Калинина, Ж. А. Акопян, Е. А. Пахомова, М. В. Шестакова, Е. В. Парфёнова
Представлено академиком В.А. Ткачуком 07.10.2008 г. Поступило 07.10.2008 г.
Гипергликемия влияет на образование и функциональные свойства кровеносных сосудов. На культуре эндотелиальных клеток (ЭК) мы обнаружили, что высокая концентрация глюкозы вызывает подавление миграции этих клеток и формирования ими капилляроподобных структур. Такое нарушение функциональной активности ЭК может объясняться выявленным нами снижением экспрессии рецепторов фактора роста эндотелия сосудов (VEGFR1/FLT1 и VEGFR2/FLK1).
Хроническая гипергликемия вызывает повреждение эндотелия и нарушение его функциональной активности, что обусловливает патологический рост кровеносных сосудов при сахарном диабете [1, 2]. Важнейшим фактором, стимулирующим миграцию, пролиферацию и формирование капилляров эндотелиальными клетками, является VEGF-A [3, 4], который взаимодействует с рецепторами 1-го и 2-го типов на поверхности этих клеток [4, 5]. Так как дисбаланс в системе регуляции ангиогенеза, вызванный гипергликемией, может быть обусловлен нарушением экспрессии рецепторов VEGF эндотелиальными клетками, в этой работе мы исследовали на культуре ЭК влияние глюкозы на миграцию ЭК, а также на экспрессию в них рецепторов VEGF.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Культура клеток. В работе использованы эндотелиальные клетки вены пуповины человека (HUVEC; human umbilical vein endothelial cells) 1-4-го пассажей, любезно предоставленные О.Н. Антоновой (лаб. клеточной адгезии ИЭК РКНПК). Клетки культивировали на пластике, покрытом 0.2%-ным раствором желатина, в среде DMEM с 10%-ным FBS (HyClone), 200 мкг/мл
ECGF, 5 ед/мл гепарина, 1 мМ пирувата натрия (GIBCO BRL), 100 ед/мл пенициллина и 100 ед/мл стрептомицина (GIBCO BRL), 20 мМ HEPES ("Helicon").
Миграция HUVEC в камере Бой-д е н а. Изучение миграции клеток проводили с использованием микрокамеры Бойдена. За сутки до эксперимента эндотелиальные клетки переводили на среду культивирования без FBS. В нижние ячейки микрокамеры Бойдена помещали среду роста с 10%-ным FBS в качестве аттрактанта. Верхние и нижние ячейки камеры разделяли мембраной с размером пор 8 мкм ("Neuro Probe Inc."), покрытой 0.1%-ным раствором коллагена I типа. В верхние ячейки камеры вносили по 1 ■ 105 HUVEC на 4 ч. Мембрану фиксировали в 96%-ном этаноле в течение 5 мин и промывали буфером, после чего счищали шпателем клетки с верхней стороны мембраны. Клетки на нижней стороне мембраны окрашивали красителем DIFF-QUICK. Мембрану сканировали и анализировали изображение при помощи программы Image-J (National Institute of Health, США). Данные выражали в единицах интенсивности окрашивания миграционного поля. В качестве отрицательного контроля использовали миграционные поля в отсутствие хемо-аттрактанта. Эксперименты повторяли трижды в 6 параллелях.
Формирование капилляроподобных структур in vitro. Для оценки формирования капилляроподобных структур 5 ■ 104 HUVEC высевали на 24-луночный планшет, покрытый матригелем без факторов роста ("BD Biosciences"), и инкубировали в среде культивирования для эндотелиальных клеток при 37°C в течение 24 ч [6]. Суммарную длину формирующихся капилляроподобных структур оценивали в 5 случайных полях зрения в каждой лунке, используя программу MetaMorph 7.1 (Universal Imaging). Эксперименты повторяли трижды в трех параллелях.
Выделение и анализ содержания мРНК с помощью ПЦР в реальном времени. Выделение общей РНК из клеток эндотелия человека проводили с использованием
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова Эндокринологический научный центр Российской Академии медицинских наук, Москва
ВЛИЯНИЕ ГИПЕРГЛИКЕМИИ НА ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ 557
Таблица 1. Влияние концентрации глюкозы в среде культивирования на функциональную активность эндотели-альных клеток
Функциональный тест Нормогликемия Периодическая гипергликемия Стабильная гипергликемия
Миграция в камере Бойдена (интенсивность окраски миграционного поля, отн. ед.), п = 18 Формирование капилляроподобных структур на матригеле (суммарная длина трубочек в лунке, мкм), п = 9 50.4 ± 0.5 2010±482 47.1 ± 0.3* 1345 ± 375* 46.2 ± 0.2* 618±396*
* p < 0.05 по сравнению с нормогликемией.
Qiagen RNeasy Mini Kit по методике, описанной в приложенном к набору руководстве пользователя. Для освобождения образцов от геномной ДНК использовали RNase Free DNase Set ("Qiagen"). Концентрацию РНК определяли по поглощению раствора РНК при длине волны 260 нм. Для проведения количественной ПЦР в реальном времени были подобраны следующие пары праймеров: VEGFR1/FLT1
Fw: 5'CAAGATTGACTTGAGAGTAACC3' Rv: 5'CTTCTAGAAATAAGGCTTCGTG3', длина ампликона 239 п.н.; VEGFR2/FLK1
Fw: 5'AAGTAATCCCAGATGACAACCA3' Rv: 5'GTTTGCACTCCAATCTCTATCAG3', длина ампликона 258 п.н. Содержание мРНК рецепторов VEGF в образцах (отн. ед. флуоресценции SYBRGreen) нормировали на содержание мРНК двух генов домашнего хозяйства: GAPDH и L7; n = 6.
Иммунофлуоресцентное окрашивание ЭК. Рецепторы VEGF выявляли на ЭК с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания, используя моноклональные антитела мыши, узнающие vEgFRI или VEGFR2 ("Abcam") и вторичные антитела осла против мыши, конъюгиро-ванные с флуорохромом Alexa595 ("Molecular Probes"), как описано ранее [6]. Ядра клеток докрашивали DAPI. Полученные препараты анализировали при помощи флуоресцентного микроскопа "ZeissAxiovert 200м". Документирование изображений производили с помощью цифровой видеокамеры AxioCam HRc и обработки в программе Axiovision ("Zeiss", Германия).
Статистическая обработка результатов. Статистический анализ данных проводили с помощью критерия Манна-Уитни (Statistica 6.0).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Гипергликемия вызывает снижение функцио-иальиой активности ЭК. Начальными этапами ан-гиогенеза являются миграция ЭК и формирование ими капилляров [7, 8]. Для оценки влияния повы-
шенной концентрации глюкозы в среде культивирования на функциональную активность ЭК мы исследовали способность этих клеток мигрировать по градиенту хемоаттрактанта, а также формировать капилляроподобные структуры in vitro. ЭК культивировали в течение 12 дней в средах роста, содержащих 5.5 или 25 мМ глюкозы. Среду меняли ежедневно, при этом часть клеток выращивали в нормогликемической среде (5.5 мМ глюкозы), часть клеток инкубировали в условиях стабильной гипергликемии (25 мМ глюкозы), а оставшиеся клетки выращивали в условиях периодической гипергликемии, чередуя среды с нормальной и высокой концентрациями глюкозы. По истечении 12 дней оценивали способность клеток мигрировать по градиенту сыворотки. Оказалось, что инкубация ЭК в условиях гипергликемии, как стабильной, так и периодической, вызывала уменьшение способности этих клеток мигрировать по градиенту сыворотки (табл. 1). При этом статистически значимых различий миграционной активности клеток, культивируемых в различных режимах гипергликемии, получено не было. Таким образом, гипергликемия per se существенно подавляет миграцию ЭК. Выявленное изменение может быть одним из факторов, определяющих угнетение роста кровеносных сосудов при заживлении ран и ишемической болезни сердца у пациентов с сахарным диабетом.
Для выяснения возможного действия гипергликемии на процессы ангиогенеза мы исследовали формирование капилляроподобных структур in vitro клетками, выращенными в среде с высокой концентрацией глюкозы. Было обнаружено, что ЭК, выращенные в условиях периодической гипергликемии, в 1.5 раза, а клетки, выращенные в условиях стабильной гипергликемии, более чем в 3 раза хуже формировали тубулярные структуры в матригеле (табл. 1). Эти данные свидетельствуют о том, что гипергликемия вызывает подавление миграции ЭК и формирования этими клетками капилляров, что может служить причиной снижения процессов ангиогенеза при диабете. При этом следует отметить, что стабильная гипергликемия обладала более выраженным повреждающим действием на ЭК, чем периодиче-
ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК том 426 < 4 2009
558
КАЛИНИНА и др.
Таблица 2. Влияние концентрации глюкозы в среде культивирования на содержание мРНК рецепторов УЕОБ в эндотелиальных клетках
Праймер Нормо-гликемия Периодическая гипергликемия Стабильная гипергликемия
VEGFR1/FLT1 VEGFR2/FLK1 1.1 + G.4 1.4 + G.6 G.3 + G.G4* G.5 + G.35* G.21 + G.18* G.6 + G.12*
* p < G.G5 но сравнению с нормогликемией.
ская. Это может быть связано с тем, что при длительной инкубации в условиях высокой концентрации глюкозы происходит некаталитическое глюкозилирование клеточных белков, которое нарушает их функции, а следовательно, и функции клетки в целом.
Гипергликемия приводит к подавлению экспрессии рецепторов VEGF. Ключевым фактором, стимулирующим миграцию и пролиферацию ЭК при ангиогенезе, является VEGF. Снижение содержания рецепторов к этому фактору роста в ЭК может вызывать подавление их миграционной способности. Для того чтобы выяснить возможные механизмы, опосредующие подавляющее действие гипергликемии на функциональную активность ЭК, мы проанализировали содержание мРНК рецепторов VEGF в этих клетках с помощью ПЦР в реальном времени и имму-нофлуоресцентного окрашивания. ЭК растили в средах с разной концентрацией глюкозы (см. выше) в течение 12 дней, после чего из части клеток выделяли мРНК, а оставшиеся клетки окрашивали антителами против рецепторов VEGF. Оказалось, что инкубация ЭК в условиях гипергликемии, как стабильной, так и периодической, вызывала уменьшение более чем в 3 раза содержания мРНК к рецептору VEGF 1-го и 2-го типов (табл. 2). С помощью иммунофлуоресцентного окрашивания клеток антителами против рецептора VEGF 1-го типа (VEGFR1/FLT1) нам не удалось выявить различий в содержании этого белка на поверхности ЭК, культивированных в условиях гипергликемии и в среде с нормальной концентрацией глюкозы. Однако количество рецептора VEGF 2-го типа (VEGFR2/FLK1) на поверхности ЭК, культивированных в условиях гипергликемии
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.