БИОХИМИЯ, 2010, том 75, вып. 8, с. 1150 — 1156
УДК 577.352
ВЛИЯНИЕ ГЛУТАМИНА НА ГИБЕЛЬ КУЛЬТИВИРОВАННЫХ ЗЕРНИСТЫХ НЕЙРОНОВ, ИНДУЦИРОВАННУЮ ГЛЮКОЗНОЙ ДЕПРИВАЦИЕЙ И ХИМИЧЕСКОЙ ГИПОКСИЕЙ
© 2010 г. Е.В. Стельмашук1*, С.В. Новикова1, Н.К. Исаев1, 2
1 НЦневрологии РАМН, Отдел исследования мозга, 105064 Москва, пер. Обуха, 5; электронная почта: estelmash@mail.ru
2 НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва; электронная почта: isaev@genebee.msu.ru
Поступила в редакцию 22.01.10 После доработки 09.03.10
С помощью специфического флуоресцентного зонда мембранного потенциала митохондрий эфира тетра-метилродамина (ТМРЭ) показано, что глюкозная депривация (ГД, 3 ч) культивированных зернистых нейронов мозжечка (КЗН) приводит к снижению мембранного потенциала митохондрий этих клеток. Более длительное глюкозное голодание (24 ч) вызывает гибель КЗН, которую не предупреждают блокаторы ионотропных глутаматных рецепторов (МК-801 10 мкМ и МВрХ 10 мкМ). Глутамин или пируват в концентрации 2 мМ поддерживают мембранный потенциал митохондрий и снижают гибель КЗН при ГД. Блокатор дыхательной цепи митохондрий ротенон в присутствии глюкозы индуцирует нейрональную гибель, которая потенцируется глутамином. Эффект потенциации полностью предупреждается блокаторами ионотропных глутаматных рецепторов. Полученные результаты демонстрируют, что глутамин во время ГД может использоваться митохондриями как субстрат, но в то же время при нарушении функционирования митохондрий метаболизм этой аминокислоты ведет к накоплению глутамата до токсического уровня.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: глутамин, зернистые нейроны мозжечка, глутамат, митохондрия, глюкозная депривация, химическая гипоксия.
Глутамат является одним из самых распространенных нейромедиаторов в головном мозге. Однако функционирование глутаматергических нейронов в центральной нервной системе зависит и от другой аминокислоты — глутамина. Из этой аминокислоты с помощью фермента мито-хондриальной глутаминазы образуется глутамат. В многочисленных исследованиях показано участие глутамата в развитии патологических состояний нервной системы, тогда как роль глу-тамина в деструктивных процессах далеко неоднозначна. Увеличение концентрации внеклеточного глутамата при ишемии может быть
Принятые сокращения: ММБА — #-метил-Б-ас-партат; КЗН — культивированные зернистые нейроны; ТМРЭ — этиловый эфир тетраметилродамина; МК-801 — (+)-5-метил-10,11-дигидро-5Н-дибензо(а,ё)циклогептен-5,10-имин малеат; МВрХ — 2,3-диоксо-6-нитро-1,2,3,4-тетра-гидробензохиноксалин-7-сульфоноамид; ГД — глюкозная депривация; АРУ — аминофосфоновалерат. * Адресат для корреспонденции.
опосредовано не только усилением его выхода из нейронов, но и его синтезом из глутамина. Подобного мнения придерживаются авторы, показавшие, что в патологических условиях при гипоксии или ишемии активность глутаминазы может значительно возрастать [1, 2]. Эти данные поддерживаются результатами Гольдберга с со-авт. [3], показавшими, что гипоксическое повреждение культивированных нейронов коры усиливается в присутствии глутамина в среде культивирования пропорционально его концентрации. Это, видимо, справедливо и для других патологических состояний, связанных с глута-матной токсичностью, например, токсическое действие параквата на культивированные зернистые нейроны мозжечка не развивается, если среда культивирования не содержит глутамин [4].
Но в то же время глутамин, вероятно, может использоваться митохондриями нейронов как энергетический субстрат, что является важным фактором для выживания нейронов в условиях дефицита глюкозы [5, 6].
В настоящей работе было исследовано влияние глутамина на поддержание мембранного потенциала митохондрий КЗН в условиях глю-козного голодания и жизнеспособность нейронов при глюкозной депривации и химической гипоксии, индуцированной ротеноном.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Все среды и добавки к ним, использованные для клеточных культур, были получены от «Biochrom KG» (Германия). Эфир тетраметил-родамина от «Molecular Probes» (США). Другие реагенты от «Sigma Chemicals» (Германия).
Первичные культуры мозжечка. В работе использовали 7—9-дневные культуры зернистых нейронов мозжечка, полученные из мозга 8-су-точных крыс линии Wistar методом ферментно-механической диссоциации, которую проводили следующим образом: выделенные мозжечки переносили в пластиковую чашку Петри, заполненную фосфатным буфером, лишенным ионов кальция и магния. Фрагменты ткани инкубировали 15 мин при 37° в фосфатном буфере, содержащем 0,05% трипсина и 0,02% ЭДТА. После инкубации ткань промывали в двух сменах фосфатного буфера и один раз средой культивирования, далее подвергали механической диссоциации в среде культивирования. Питательная среда содержала: 10%-ную эмбриональную телячью сыворотку, 2 мM глутамина и 10 мM буфера НЕРЕS, pH 7,2—7,4. Суспензию клеток центрифугировали 1 мин при 1000 об/мин, су-пернатант сливали, а осадок ресуспендировали в питательной среде. Культивирование производили в 96-луночных пластиковых камерах, покрытых полилизином. В каждую ячейку добавляли 0,1 мл суспензии клеток. Культуры развивались в СО2-инкубаторе, при температуре 36,5° и относительной влажности 98%. На второй день in vitro, среда заменялась свежей, содержащей 25 мM KCl, в которой культивирование клеток продолжали до 7—8 дня in vitro. Для предотвращения пролиферации не нейрональных клеток в среду культивирования на второй день in vitro добавляли арабинозид моноцитозид до конечной концентрации 1 мкM.
Обращение с животными и экспериментальные процедуры с ними были выполнены в соответствии с Директивами совета Европейского сообщества 86/609/ЕЕС об использовании животных для экспериментальных исследований и одобрены Этической комиссией MTO
Глюкозная депривация и химическая гипоксия. Для инициации глюкозной депривации (ГД) культивированные клетки дважды промывали
сбалансированным солевым раствором, содержащим (в мМ): NaCl 154, KCl 25, CaCl2 2,3, MgCl21, NaHCO3 23,8, Na2HPO4 0,35, HEPES 10), pH 7,2—7,4, и инкубировали 3—24 ч в СО2-инку-баторе при температуре 36,5° и относительной влажности 98%.
Контрольные культуры инкубировали в сбалансированном солевом растворе с добавлением глюкозы (5 мМ). Обработку культур ротеноном (1 мМ, 2 ч) проводили в сбалансированном солевом растворе, содержащем глюкозу.
Измерение мембранного потенциала митохондрий. Для анализа мембранного потенциала митохондрий клетки инкубировали с 0,1 мкМ эфира тетраметилродамина (ТМРЭ, возбуждение 530 нм и эмиссия 640 нм) 15 мин при 36,5 ± 0,5° и трижды промывали сбалансированным солевым раствором. Являясь проникающим катионом, ТМРЭ входит только в функционально активные митохондрии, имеющие потенциал на внутренней мембране. Флуоресценцию родамина регистрировали с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа (Olympus CKX41), оснащенного высокочувствительной цифровой камерой. Интенсивность свечения ТМРЭ, отражающую величину мембранного потенциала, измеряли в отдельных митохондриях 10 клеток с поля зрения с помощью программ компьютерного анализа изображения. Все манипуляции с клетками проводили при 34—36°.
Оценка выживаемости нейронов. После эксперимента культуры фиксировали в смеси этанол—формальдегид—уксусная кислота (7 : 2 : 1) и окрашивали трипановым синим. Процент выживших нейронов оценивали подсчетом морфологически интактных ядер КЗН в пяти полях зрения при увеличении объектива х40. Выживаемость нейронов в необработанных контрольных культурах принимали за 100%, выживаемость в экспериментальных культурах выражали в процентах относительно контроля.
Статистический анализ. Для статистического анализа использовали тест ANOVA с посттестом Bonferroni. Отличия между группами считали достоверными приp < 0,05. Результаты выражали как среднее ± SEM. Все данные получены на 9 культурах в трех независимых экспериментах.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Влияние глутамина на мембранный потенциал митохондрий КЗН в условиях глюкозного голодания. Результаты наблюдения живых культур и исследования гистологических препаратов показали, что нейронная популяция культур, полученных из мозжечков 7-8-дневных крыс, бы-
ла представлена практически только одним типом нейронов — клетками-зернами, другие типы нейронов мозжечка в полученных диссоциированных культурах отсутствовали. КЗН располагались на глиальном монослое.
Энергизацию митохондрий в живых КЗН визуализировали с помощью регистрации флуоресценции ТМРЭ, накопление которого в митохондриях происходит в зависимости от величины мембранного потенциала этих органелл. После 3 ч инкубации культур в содержащем глюкозу сбалансированном солевом растворе митохондрии нейронов активно накапливали ТМРЭ, который при облучении зеленым светом имел интенсивную красную флуоресценцию (рис. 1, а). В КЗН, размер которых составляет всего 7—10 мкм, основную часть клетки занимает ядро, окруженное тонким ободком цитоплазмы, наибольшее количество которой находится в местах отхождения отростков. Эти клетки слабо распластаны по субстрату и часто имеют почти сферическую форму тела. В связи с этими морфологическими особенностями КЗН при наблюдении культур на светооптическом уровне митохондрии видны как мелкие светящиеся па-
лочки или точки (на рисунке отмечены стрелками), расположенные вокруг темного ядра. В сестринских культурах, инкубированных такое же время в лишенном глюкозы сбалансированном солевом растворе, накопление ТМРЭ в митохондриях нейронов снижалось (рис. 1, б) до 45 ± 1,8% по сравнению с контролем (рис. 1). Морфологическая картина в этих условиях кажется размытой. При полном отсутствии мембранного потенциала митохондрий мы наблюдали полное отсутствие флуоресценции, когда о наличии КЗН в поле зрения можно судить, только сопоставляя с фазовым контрастом этого поля зрения.
Добавление глутамина (2 мМ) в безглюкоз-ный сбалансированный солевой раствор поддерживало накопление ТМРЭ в митохондриях (рис. 1, в), что указывало на наличие мембранного потенциала у этих органелл. Относительная флуоресценция ТМРЭ в митохондриях нейронов в этих условиях была в средн
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.