КРИСТАЛЛОГРАФИЯ, 2010, том 55, № 3, с. 516-525
ЖИДКИЕ КРИСТАЛЛЫ ^
УДК 577.352.27
ВЛИЯНИЕ ХОЛЕСТЕРИНА И ЦЕРАМИДА-VI НА СТРУКТУРУ МНОГОСЛОЙНЫХ ЛИПИДНЫХ МЕМБРАН ПРИ ВОДНОМ ОБМЕНЕ © 2010 г. Н. Ю. Рябова*, **, М. А. Киселёв*, А. М. Балагуров*
*Объединенный институт ядерных исследований, Дубна **Научно-исследовательский институт ядерной физики Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова E-mail: rny03@nf.jinr.ru Поступила в редакцию 09.06.2009 г.
Представлены результаты нейтронного дифракционного эксперимента, полученные при изучении структурных изменений в многослойных липидных мембранах двойных систем ДПФХ/холестерин и ДПФХ/церамид-VI (ДПФХ — дипальмитоилфосфатидилхолин) в ходе процессов гидратации и дегидратации. Охарактеризовано влияние холестерина и церамида на кинетику водного обмена в мембране ДПФХ. По сравнению с чистым ДПФХ набухание мембран двойных систем в процессе гидратации происходит быстрее и имеет характерное время ~30 мин. Оба соединения, церамид-VI и холестерин, оказывают одинаковый эффект на гидратацию мембраны, приготовленной из ДПФХ, увеличивая период повторяемости за счет увеличения толщины бислоя. Однако в отличие от холестерина, церамид значительно снижает толщину водного слоя мембраны. Введение холестерина в мембрану ДПФХ замедляет изменение параметров внутренней структуры бислоя при дегидратации. В тройной системе ДПФХ/церамид-"УТ/холестерин при мольной концентрации 40% холестерин частично выделяется из ламеллярной структуры мембраны в кристаллическую фазу.
ВВЕДЕНИЕ
Многослойные ориентированные липидные мембраны на подложках продолжают оставаться важным модельным объектом для изучения биофизических характеристик реальных биологических мембран. Их основные структурные характеристики, в число которых входят период повторяемости ламеллярной структуры, толщина липидного бислоя, размеры гидрофильной и гидрофобной областей, конформация углеводородных цепей и т.д., могут быть определены с помощью хорошо отработанных методов рентгеновской или нейтронной дифракции. Одним из актуальных вопросов является зависимость структурной организации мембраны от степени ее гидратации, т.е. от состояния водной прослойки между полярными областями липидных би-слоев. Как правило, такого рода исследования выполняются в стационарных условиях, т.е. при фиксированном уровне влажности окружающей среды или же в избытке воды [1]. Дифракционные исследования кинетики водного обмена в ли-пидных многослойных структурах уже проводились [2], но они ограничивались регистрацией изменений во времени структурного фактора только одного, наиболее интенсивного дифракционного пика, что не позволяло следить за изменениями структуры в ходе процесса. Недавно в наших нейтронных дифракционных эксперимен-
тах, выполненных на ориентированных мембранах, приготовленных из дипальмитоилфосфати-дилхолина (ДПФХ), удалось одновременно измерять несколько (до 5) порядков отражения от ламеллярных слоев и это дало возможность проследить эволюцию внутренней структуры мембраны непосредственно в ходе кинетических процессов ее гидратации и дегидратации. Эксперименты были проведены на высокопоточном импульсном реакторе ИБР-2 (Дубна) по оригинальной методике (дифракция в реальном времени) и позволили помимо структурной информации получить данные о характерных временах процессов [3]. В продолжение этих исследований в настоящей работе представлены результаты аналогичных нейтронных дифракционных экспериментов с мембранами ДПФХ, в которые в определенном соотношении встраивались молекулы холестерина и церамида-У1. Эти молекулы оказывают значительное влияние на свойства и функционирование реальных биологических мембран клетки, что и обусловило их выбор. Кроме того, в работе представлены результаты по структуре ориентированной мембраны, приготовленной на основе тройной системы ДПФХ/церамид-У1/хо-лестерин с мольным соотношение компонент 3:3:4.
СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЛИПИДНЫХ МЕМБРАН С ХОЛЕСТЕРИНОМ И ЦЕРАМИДОМ
Структура ориентированных многослойных мембран из ДПФХ при различной степени их гидратации хорошо изучена. При комнатной температуре и влажности окружающей среды 60% ли-пидный бислой находится в гель-фазе, характеризующейся хорошо упорядоченной конформацией углеводородных цепей, наклоненных относительно нормали к поверхности бислоя, периодом повторяемости в ламеллярном (перпендикулярном поверхности мембраны) направлении около 60 А и толщиной водной прослойки между бислоями около 8 А. Период ламеллярной структуры и толщина бислоя полностью гидратированной мембраны при 20°С равны соответственно ~63.5 и ~48 А [1].
Церамиды (рис. 1) являются основным компонентом липидной матрицы stratum corneum (SC), верхнего слоя эпидермиса млекопитающих, выполняющего барьерные функции кожи. Из-за низкой растворимости в воде и неспособности самоорганизовываться в липидный бислой цера-миды исследуются либо в составе многокомпонентных систем, либо в смесях с фосфолипидами. Исследования ориентированной многослойной модельной мембраны SC церамид-У1/пальмити-новая кислота/холестерин/сульфат холестерина с весовым соотношением компонент 55/25/15/5 показали, что по сравнению с фосфолипидными мембранами гидратация этой системы в избытке воды идет очень медленно: характерное время набухания мембраны SC составляет 93 мин (для фосфолипидов ~ минуты) [4]. В [4, 5] выдвинуто предположение о том, что основой медленной гидратации модельной мембраны SC и малого межмембранного пространства (около 1 А в гид-ратированной в избытке воды мембране, по сравнению с ~16 А в мембране ДПФХ) является полностью вытянутая конформация молекул цера-мида-VI, стягивающая соседние бислои до тесного контакта друг с другом. Исследование однослойных везикул этой же системы методом малоуглового рассеяния нейтронов и расчеты на основе разделенных формфакторов показали, что структура бислоя однослойных везикул отличается от структуры бислоев ориентированной мембраны [6]. Однослойные везикулы, в которых це-рамид-VI находится в односторонней конформа-ции, способны образовывать кластеры при сферическом контакте везикул друг с другом за счет переворота углеводородной цепочки молекулы церамида, т.е. перехода церамида в полностью вытянутую конформацию. В [7], посвященной исследованию мембраны ДПФХ с 32 мол. % цера-мида-VI (одного из девяти типов церамидов ли-пидной матрицы SC) при низком уровне относительной влажности показано, что добавление це-
CH3
ДПФХ
H3C
Холестерин Церамид-VI
Рис. 1. Схематическое изображение молекул ДПФХ, холестерина и церамида-VI, состоящих из полярной головы (выделена круговой линией) и неполярных углеводородных цепей.
рамида в мембрану значительно увеличивает толщину гидрофобной области бислоя и, наоборот, уменьшает толщину водной прослойки между бислоями. В [8] обнаружено, что молекулы це-рамида-VI увеличивают период повторяемости (d) мембраны мультислойных и однослойных везикул димиристоилфосфатидилхолина, причем наблюдается линейная зависимость между d и мольной концентрацией церамида до 25%.
В смесях фосфолипида и холестерина при высоких концентрациях последнего была обнаружена фаза с высокой степенью упорядоченности углеводородных цепочек в жидкокристаллическом состоянии, названная жидкой упорядоченной фазой L0 (liquid ordered phase) [9]. Бислой в фазе L0 обладает свойствами, промежуточными между свойствами, характерными для бислоя в гель-фазе Lp и жидкокристаллической фазе La. Рентгеновские исследования показали, что толщина ли-пидного бислоя, находящегося в фазе L0, является средней величиной между толщинами бислоя чистого фосфолипида в фазах Lp (~48 А) и La (~39 А) [1, 10]. Согласно предложенной в [11] модели липидных плотов (lipidrafts), именно в фазе L0 находятся микродомены (плоты) липидного
бислоя клеточной мембраны, обогащенные холестерином и церамидами, "плавающие" среди жидкого неупорядоченного бислоя фосфолипи-дов и служащие платформой для осуществления клеточных функций.
Для наиболее изученной двойной системы ДПФХ/холестерин построено несколько фазовых диаграмм, иногда существенно отличных друг от друга. Согласно диаграмме в [12], ниже температуры фазового перехода (~38°С) система характеризуется сосуществованием жидкой упорядоченной Х0- и гелевой Хр-фаз при мольной концентрации холестерина 5% < ххол < 22% и наличием только жидкой упорядоченной фазы во всем температурном интервале при ххол > 25%. В рентгеновских дифракционных экспериментах на ориентированных образцах при относительной влажности 98% обнаружена новая модулированная фаза, обозначенная как Рр, с ламеллярной периодичностью около 65 А, периодом в латеральном направлении и амплитудой модуляции соответственно ~70 и около 2.5 А [13]. Углеводородные цепочки липидов в этой фазе перпендикулярны поверхности мембраны, толщина бис-лоя оценивается ~50 А. При температурах ниже температуры предперехода (34°С) к основному фазовому переходу система ДПФХ/холестерин при 15% < ххол < 20% — находится в состоянии Рр, а при ххол > 22% в жидком упорядоченном состоянии Х0. Следует отметить, что при построении фазовых диаграмм точное определение указанных граничных концентраций холестерина в этих работах не выполнялось.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОД
Материалы и приготовление образцов. Дипаль-митоилфосфатидилхолин (ДПФХ) и ^(а-гид-роксооктадеканоил)-фитосфингозин (церамид-У1) были синтезированы фирмой "Со8шоГегш" (Нидерланды). Холестерин приобретен в фирме та-АЫйсИ" (Сигма-Алдрич Россия). Тяжелая вода (чистота 99.8%) была приобретена в фирме "Изотоп" (Санкт-Петербург). Кварцевые пластины '^рес^о8П 2000" приобретены в компании '^аШ;^оЪат" (Германия).
При выборе соотношения компонент в двойных системах мы руководствовались стремлением получить однофазный образец с максимальной концентрацией холестерина и церамида. Были приготовлены образцы двойных систем ДПФХ/церамид-У1 с мольным соотношением компонент 3:2, ДПФХ/холестерин с мольным соотношением компонент 4:1 и образец тройной системы ДПФХ/церамид-У1/холестерин с мольным соотношением компонент 3:3:4. Для получения образцов использовалась стандартная процедура приготовления о
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.