ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2012, том 445, № 5, с. 594-596
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, ^^^^^^^^ МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 577.112; 577.336
ВЛИЯНИЕ ХРОМОФОР-БЕЛКОВЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ НА СПЕКТРАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ЖЕЛТОГО ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО БЕЛКА © 2012 г. А. А. Пахомов, С. А. Третьякова, В. И. Мартынов
Представлено академиком А.И. Мирошниковым 06.03.2012 г. Поступило 12.03.2012 г.
Для исследования процессов, происходящих в живых системах, в настоящее время широко используют различные спектральные варианты белков семейства зеленого флуоресцентного белка
*
(GFP) [1]. Эти белки обладают уникальной способностью автокаталитического синтеза хромофора из собственных аминокислот. В результате возникают хромофорные группы различного типа и происходит "грубая" настройка на определенный спектральный диапазон [2—7]. Кроме того, в отличие от низкомолекулярных флуорофо-ров, эмиссия белков семейства GFP подвергается "тонкой" настройке на определенную длину волны за счет различных нековалентных взаимодействий хромофора с его аминокислотным окружением. Согласно цвету флуоресценции, белки этого семейства можно условно разделить на группы: синие, циановые, зеленые, желтые, оранжевые, красные, дальне-красные и излучающие свет в ближней ИК-области.
В отличие от множества белков, флуоресцирующих в зеленой области спектра, природные белки с желтой флуоресценцией представлены не столь многочисленным набором вариантов. Ранее было показано, что желтый флуоресцентный белок zFP538 из кораллового полипа Zoanthus sp. (максимумы возбуждения и эмиссии при 528 и 538 нм) содержит модифицированный хромофор GFP-типа, что является причиной батохромного сдвига его спектров по сравнению с GFP (максимумы возбуждения и эмиссии при 395 и 508 нм) [8, 9]. В то же время желтый флуоресцентный белок phiYFP из медузы Phialidium sp., обладающий схожими с zFP538 спектральными характеристи-
* Сокращения: GFP — зеленый флуоресцентный белок из Aequorea victoria; zFP538 — желтый флуоресцентный белок из кораллового полипа Zoanthus sp.; phiYFP — желтый флуоресцентный белок из медузы Phialidium sp.
Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии наук, Москва
ками (максимумы возбуждения и эмиссии при 522 и 537 нм) [10], содержит немодифицирован-ный хромофор GFP-типа [11]. Таким образом, в отличие от zFP538, спектральные свойства phiYFP являются следствием необычных хромофор-белковых взаимодействий.
Ранее с помощью гомологичного моделирования [12] была построена трехмерная структура белка phiYFP [11]. В настоящей работе эту модель использовали для исчерпывающего направленного мутагенеза с целью замены аминокислот, находящихся в окружении хромофора. Для каждого полученного варианта исследовали влияние аминокислотной замены на спектральные свойства белка.
При сравнении кристаллической структуры GFP [13] и модели трехмерной структуры phiYFP, а именно аминокислот в непосредственной близости от хромофора (рис. 1а, б), становится очевидным, что окружение 5-членного гетероциклического кольца хромофора в обоих белках похоже, включая остатки Arg96 и Glu222. Однако, в отличие от GFP (рис. 1а), в белке phiYFP остаток Glu222 не образует цепи водородных связей с Ser205 и далее с кислородом фенолята хромофора (рис. 1б), поскольку вместо Ser в этой позиции находится Val. В отличие от GFP, в позиции 203 белка phiYFP находится Tyr в GFP (в этой же позиции имеется Thr203), который, согласно предложенной модели, располагается в непосредственной близости от фенольного кольца хромофора и способен образовывать с ним нековалентную связь с помощью я—я-стэкинг-взаимодействий.
Как и у GFP, спектр поглощения phiYFP в видимой области содержит два основных пика. Для природного белка дикого типа характерен основной пик при 522 нм, который, по-видимому, соответствует анионной форме фенолята хромофора (табл. 1, полоса В), и минорный пик при 412 нм, соответствующий протонированному фенолу (полоса А). Следует отметить, что как белок дикого типа, так и все полученные мутантные варианты phiYFP имели полосу возбуждения в области
ВЛИЯНИЕ ХРОМОФОР-БЕЛКОВЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ
595
(a)
Arg96
Gln94
Thr203
N.
"NH Y~NH^ ,H2N-
h2n
-N O , N I
His148 H H
/ O
146[ H h
4 h
OO R
R
'O
4^ H H„
J
Ser205 Glu222
0
1
H
(б)
Tyr84
His148
Arg96 Gln69 NH
\ >-NH24
л h2n *
2 ®
Ж O í >
o
Gln94
NH^ H2N-
V o
R R
Thr65
Val205
Glu222
Рис. 1. Хромофор и его окружение в белке GFP из Aequorea victoria (а) и в белке дикого типа phiYFP из Phialidium sp. (б). Водородные связи обозначены штриховыми линиями. Хромофор отмечен полужирным.
поглощения анионной формы, но не нейтрального хромофора.
Для того чтобы оценить вклад я-я-стэкинг-взаимодействий в общий сдвиг спектров флуоресценции по сравнению со спектрами GFP, были сконструированы мутантные варианты желтого флуоресцентного белка с заменой Tyr203 на Val и Thr. Вариант белка Y203V имел максимумы возбуждения и эмиссии соответственно при 512 и 525 нм. Поскольку Val является алифатической аминокислотой, эти результаты предполагают, что я—я-стэкинг-взаимодействия вносят лишь небольшой вклад (~10 нм) в общий сдвиг эмиссии phiYFP (~30 нм) по сравнению с GFP. Вариант Y203T имел максимумы возбуждения (501 нм) и эмиссии (516 нм), еще более сдвинутые в синюю область спектра. Для химических соединений, подобных хромофору флуоресцентных белков, известно, что при возбуждении происходит частичный перенос отрицательного заряда от фенолята к гетероциклическому кольцу [14]. В варианте GFP S65T остаток Thr203 образует водородную связь с фенольным кислородом хромофора [15], стабилизируя отрицательный заряд фенолята, препятствуя его переносу к гетероциклу и, таким образом, вызывая гипсохромный сдвиг. Такой же эффект предполагается и в варианте Y203T phiYFP. Этот эффект, однако, отсутствует в варианте Y203V, что означает пониженную стабилизацию отрицательного заряда фенолята и дополнительный (~10 нм) вклад в общий батохром-ный сдвиг эмиссии phiYFP (сравнить максимумы эмиссии Y203V и Y203T, табл. 1).
Подобную же стабилизирующую роль отрицательного заряда фенолята, хотя и в меньшей степени, может осуществлять остаток Ser205. Этот
остаток, согласно кристаллической структуре GFP, также связан водородной связью через молекулу воды с фенольным кислородом хромофора (рис. 1а). Наличие такой стабилизации может объяснить гипсохромный сдвиг в спектрах варианта phiYFP V205S по сравнению со спектрами белка дикого типа (табл. 1).
Как уже отмечалось выше, в отличие от GFP, Glu222 в белке phiYFP не образует водородной связи с Ser205 (рис. 1а, б), поскольку в позиции 205 белка phiYFP находится Val. Таким образом, в белке phiYFP нет цепи водородных связей, соединяющих фенольный кислород хромофора с карбоксильной группой Glu222. В соответствии с
Таблица 1. Спектральные свойства мутантных вариантов phiYFP (нм)
Белок Поглощение Возбуждение Эмиссия
Полоса A Полоса B
phiYFP а 412 522 522 537
- Y203V 404 512 512 525
- Y203T - 500 500 516
- V205S 407 516 516 529
- T65V 410 516 516 527
- E222Q 413 517 517 530
- V42L - 523 523 535
- F145Y - 524 524 537
- L150V 415 522 522 532
- S163V - 524 524 537
Примечание. Прочерк означает, что полоса поглощения А отсутствует.
а рЫУБР — белок дикого типа.
596
ПАХОМОВ и др.
Рис. 2. Пространственное расположение аминокислотных остатков, подвергавшихся замене с помощью мутагенеза, в структуре белка. Хромофор в структуре обозначен как CRO.
моделью phiYFP [11] Glu222 существует в нейтральной форме и связан водородными связями через гидроксильную группу Thr65 с атомом N(2) гетероциклического кольца. Известно, что при возбуждении светом основность этого атома азота резко возрастает [14], что может приводить к переносу на него протона от Glu222. Таким образом, в результате возбуждения светом возможно образование протонированной по азоту формы хромофора, что может объяснить дополнительный батохромный сдвиг phiYFP. Для проверки этого предположения в сконструированных вариантах T65V и E222Q были нарушены водородные связи Glu222 с атомом N(2). Как следует из табл. 1, обе замены вызывают гипсохромный сдвиг, подтверждая важное значение водородных связей Glu222 с атомом азота гетероцикла.
Кроме того, было изучено влияние стериче-ских факторов на спектральный сдвиг белка. Аминокислотные остатки в окружении хромофора задают размер и свойства полости, в которой он находится, и определяют его подвижность. Были проведены замены по позициям, несущим аминокислотные остатки, отличные от GFP, и получены мутантные варианты с измененной геометрией полости хромофора phiYFP V42L, F145Y, L150V и S163V (рис. 2). Спектральные свойства этих мутантов незначительно отличались от свойств белка дикого типа (табл. 1). Таким обра-
зом, геометрия полости задает фиксированную позицию хромофора в пространстве, однако не оказывает значительного влияния на величину батохромного сдвига.
Полученные результаты позволяют сделать заключение, что настройка флуоресценции белков семейства GFP в желтом спектральном диапазоне может осуществляться за счет различных некова-лентных взаимодействий GFP-подобного хромофора с белковым окружением. Сравнительный анализ мутантов phiYFP показал, что сразу несколько факторов определяют фотофизические характеристики желтого флуоресцентного белка и вклад этих факторов имеет, по-видимому, аддитивный характер.
Работа выполнена при поддержке Президиума РАН (программа "Молекулярная и клеточная биология"), РФФИ (гранты 12-04-00076-а, 10-04-00471-а), а также Министерства образования и науки РФ (госконтракт в рамках ФЦП "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы").
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Chudakov D.M., Matz M.V., Lukyanov S., Lukya-nov K.A. // Physiol. Revs. 2010. V 90. P. 1103-1163.
2. Pakhomov A.A., Martynov V.I. // Chem. Biol. 2008. V. 15. P. 755-764.
3. Пахомов A.A., Мартынов В.И. // Биохимия 2009. V. 74. P. 309-319.
4. Пахомов А.А., Третьякова Ю.А., Мартынов В.И. // Биоорган. химия 2010. V. 36. P. 117-121.
5. Pakhomov A.A., Martynov V.I. // Biochemistry. 2007. V. 46. P. 11528-11535
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.