ИЗВЕСТИЯ РАИ. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2008, № 4, с. 409-413
БИОЛОГИЯ ^^^^^^^^^^^^^^^^ КЛЕТКИ
УДК 577.122:577.123
ВЛИЯНИЕ ХРОНИЧЕСКОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ у-ИЗЛУЧЕНИЯ И 90Sr В МАЛЫХ ДОЗАХ НА УРОВЕНЬ РАЗРЫВОВ ДНК И ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ К ПЕРЕКИСИ ВОДОРОДА КЛЕТОК СЕЛЕЗЕНКИ МЫШЕЙ
© 2008 г. Е. Ю. Лизунова, Н. Ю. Воробьева, А. Н. Осипов
Институт химической физики им. ИИ. Семенова РАИ, 119991 Москва, ул. Косыгина, 4 Е-mail: andreyan.osipov@rambler. ru Поступила в редакцию 05.04.2007 г.
С помощью метода ДНК-комет показано, что у самцов мышей линии СВ A/lac, подвергавшихся воздействию у-излучения (1.7 мГр/сут) или 90Sr (150-250 Бк/сут) в течение 210 сут, отмечается статистически достоверное (р < 0.01) увеличение уровня разрывов ДНК в клетках селезенки. При совместном воздействии у-излучения и 90Sr уровень разрывов ДНК также увеличен (р < 0.05), но в меньшей степени, чем при раздельном воздействии. При дополнительном воздействии перекиси водорода на клетки селезенки мышей in vitro прирост количества разрывов ДНК в клетках облученных мышей ниже, чем в контроле. Отношение уровня разрывов ДнК после обработки перекисью водорода к исходному уровню у контрольных животных равно 4.2 ± 0.9, а у животных подвергавшихся воздействию у-излучения - 1.4 ± 0.6; 90Sr - 1.9 ± 0.8; 90Sr и у-излучения - 2.3 ± 0.8.
Результаты многочисленных эпидемиологических и популяционных исследований (Аклеев и др., 2004; Пелевина и др., 2004; Осипов, 2004) свидетельствуют о том, что хроническое облучение в малых дозах может приводить к изменению чувствительности клеток к дополнительному воздействию различных повреждающих агентов, как физической, так и химической природы. Однако трудности с оценкой дозовых нагрузок, популяци-онные эффекты и наличие сопутствующих факторов не позволяют сделать однозначное заключение о радиогенном характере наблюдаемых эффектов. В то же время экспериментальные исследования биологических эффектов облучения в малых дозах проводятся довольно редко, что связано с большими временными затратами на проведение таких экспериментов.
Цель нашей работы состояла в изучении влияния хронического воздействия у-излучения 90Sr в малых дозах на уровень разрывов ДНК в клетках мышей in vivo и чувствительность клеток селезенки к действию перекиси водорода in vitro.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Эксперименты проводили на мышах-самцах линии СВАЛас исходной массой 14-16 г, полученных из питомника "Столбовая" РАМН (Московская обл.) В течение эксперимента мышей содержали на стандартном рационе вивария (сухой гранулированный корм и вода ad libitum). Состав рациона не менялся. Распределение животных на
4 группы (I - контроль, II - воздействие у-излучения, Ш - воздействие 9^г, IV - одновременное воздействие 9^г и у-излучения) по 10 животных в каждой проводили путем случайной выборки.
Животных групп "II" и "IV" подвергали круглосуточному воздействию у-излучения на установке УОГ-1 ("Изотоп", Россия) (13^). Мощность поглощенной дозы составляла 1.7 мГр/сут. Раствор хлорида 9^г из расчета 50 Бк/мл давали животным групп "Ш" и "IV" вместо питьевой воды. По нашим расчетам, одна мышь выпивала в сутки приблизительно 3-5 мл раствора.
На 210-е сут эксперимента животных умерщвляли путем цервикальной дислокации и извлекали селезенку. Селезенку гомогенизировали в охлажденном до 4^ фосфатно-солевым буфером (137 мМ №0, 2.7 мМ КС1, 10 мМ Ш^^, 2 мМ K2HРО4 рН 7.4) (1 мл буфера на 10 мг ткани лимфоидного органа). Суспензию клеток фильтровали через нейлоновую сетку. Концентрацию клеток определяли в камере Горяева с помощью микроскопа типа SK-14 фирмы "PZO" (Польша).
Для изучения чувствительности клеток селезенки к воздействию перекиси водорода суспензию клеток (1-2 х 106 кл./мл) инкубировали 30 мин при 37^ в фосфатно-солевом буфере (рН 7.4) с добавлением перекиси водорода в концентрации 5 мМ.
Уровень разрывов ДНК оценивали методом нейтрального электрофореза единичных клеток (метод ДНК-комет) (Wojewodzka в1 а1., 2002).
Уровень разрывов ДНК (% ДНК в "хвосте") в клетках селезенки контрольных животных и мышей, подвергавшихся хроническому воздействию у-излучения и/или 908г
Группа Контроль у-излучение 90Sr 90Sr + у-излучение
% ДНК в "хвосте" 1.88 ± 0.42 4.62 ± 0.28** 4.83 ± 0.35** 3.49 ± 036*
* p < 0.05. ** p < 0.01.
Уровень разрывов ДНК, определяемых этим методом, прямо пропорционален количеству ДНК, мигрировавшей из ядерной области после проведения электрофореза ДНК иммобилизованных в агарозу единичных клеток. Электрофорез проводили в течение 20 мин в охлажденном (4°C) трис-боратном буфере (рН 8.2) при напряжении 1 В/см. ДНК окрашивали 10 мин акридиновым оранжевым (2 мкг/мл) в фосфатнo-солевом буфере (рН 7.4). ДНК-кометы визуализировали с помощью микроскопа Микмед-2, вариант 11 (ЛОМО, Россия) и компьютерной видеосистемы на основе цифровой камеры Nikon CoolPix-4500 (ДиаМорф, Россия). Для анализа ДНК-комет использовали программу CometScore (TriTek Corp., США). Оценивали долю ДНК, мигрировавшей из ядерной области (% ДНК в "хвосте"). Для каждого животного анализировали 3 слайда по 50 ДНК-комет без дополнительной обработки клеток перекисью водорода и 3 слайда по 50 ДНК-комет после обработки клеток перекисью водорода.
Статистическую обработку результатов измерений проводили с использованием t-критерия Стьюдента. Результаты исследований разрывов ДНК представлены как средние для групп животных. Для построения клеточных распределений использовались объединенные для каждой группы животных данные (1500 ДНК-комет в каждом распределении).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИССЛЕДОВАНИЯ
Проведенные исследования показали, что длительное воздействие низкоинтенсивного у-излу-чения или 90Sr приводит к статически достоверному и примерно одинаковому увеличению уровня разрывов ДНК в клетках селезенки мышей (таблица). Обращает на себя внимание тот факт, что при одновременном воздействии у-излучения и 90Sr уровень разрывов ДНК достоверно (р < 0.05) ниже, чем при раздельном воздействии у-излучения и 90Sr. Анализ распределений клеток селезенки по уровню разрывов ДНК у контрольных и хронически облученных мышей свидетельствует, что увеличение уровня разрывов ДНК у мышей, подвергавшихся раздельному воздействию у-излучения или 90Sr, происходит главным образом за счет реакции основного пула клеток, а не за счет появления субпопуляций клеток с высо-
ким уровнем повреждений ДНК и апоптотиче-ских клеток, характеризующихся высокой степенью фрагментации ДнК (рис. 16, в). У мышей, подвергавшихся одновременному воздействию у-излучения и 90Sr характер распределения несколько иной: при более низком общем уровне разрывов ДНК доля клеток с высоким уровнем разрывов ДНК выше, чем при раздельных воздействиях (рис. 1г).
Результаты исследований уровня разрывов ДНК в клетках селезенки контрольных и облученных мышей после их обработки перекисью водорода in vitro показали, что дополнительное воздействие приводит к достоверному увеличению уровня разрывов ДНК в клетках селезенки как контрольных, так и облученных животных (рис. 2). Статистически достоверных различий между уровнями разрывов ДНК после воздействии перекиси водорода в клетках облученных и контрольных мышей не обнаружено. Однако прирост количества разрывов ДНК индуцированных перекисью водорода у облученных животных гораздо ниже, чем у контроля. Отношение уровня разрывов ДНК после обработки перекисью водорода к исходному уровню у контрольных животных равно 4.2 ± 0.9, а у животных подвергавшихся воздействию у-излучения - 1.4 ± 0.6; 90Sr - 1.9 ± 0.8; 90Sr и у-излучения - 2.3 ± 0.8.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
В отличие от воздействия внешнего у-излучения, когда происходит практически равномерное облучение мягких тканей, характер облучения селезенки Р-частицами, образующимися при распаде 90Sr и его дочернего продукта 90Y, является иным. Общеизвестно, что Sr, являясь химическим аналогом Са, после всасывания через желудочно-кишечный тракт в кровь аккумулируется в костной ткани. Энергия и, соответственно, длина пробега Р-частиц, образующихся при распаде 90Sr, малы (Е = 0.2 МэВ, длина пробега в мягких тканях ~1 мм). Поэтому селезенка у мышей может облучаться в основном высокоэнергетическими Р-частицами (Е = 0.94 МэВ, длина пробега в мягких тканях ~4.3 мм), образующимися при распаде 90Y, который находится в постоянном равновесии co 90Sr. Учитывая тот факт, что в нашем эксперименте при внутреннем облучении 90Sr средняя
(а)
% клеток
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0 50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16
(б)
j-tl _ ИДзЬозО
(г)
0 2 4 6 8 10 12 14 16
% ДНК в "хвосте"
Рис. 1. Распределение клеток селезенки контрольных и облученных мышей по уровню разрывов ДНК (% ДНК в "хвосте"): а - контроль, б - у-излучение, ]
90Sr, г - 90Sr и у-излучение.
суммарная поглощенная доза, рассчитанная на костную ткань, составила ~1 cÉp, то дозовая нагрузка, приходящаяся на селезенку, будет еще меньше и несоизмерима с дозой, полученной селезенкой при внешнем воздействии у-излучения (-35.7 сГр). Тем не менее, результаты наших исследований показали, что выраженность наблюдаемого нами эффекта (увеличение уровня разрывов ДНК) примерно одинакова, как при внешнем воздействии у-излучения, так при внутреннем облучении 90Sr. В то время как при совместном воздействии у-излучения и 90Sr регистрируется даже уменьшение уровня разрывов ДНК. Полученные результаты трудно объяснимы с позиций классической радиобиологии и. в очередной раз свидетельствуют в пользу развиваемой в настоящее время гипотезы о важной роли "немишенных" эффектов ("bystander''-эффект) в развитии клеточного ответа на низкоинтенсивное облучение. Согласно этой гипотезе выраженность эффекта при облучении в малых дозах зависит не столько от числа пораженных мишеней (клеток), сколько от отклика всего клеточного пула на воздействие и, соответственно, не зависит линейно от дозы облучения. Сигнал от облученной клетки может передаваться как посредством прямых межклеточных контактов (gap junction communication), так и посредством молекул, продуцируемых клетками, т.е. через систему цитокинов
и/или активных форм кислорода (Lorimore, Wright
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.