ФИЗИОЛОГИЯ ЧЕЛОВЕКА, 2015, том 41, № 2, с. 109-112
= МЕТОДИКА =
УДК 612.112.9.014.43
ВЛИЯНИЕ ИНЕРТНОГО ГАЗА КСЕНОНА НА ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ЯДРОСОДЕРЖАЩИХ КЛЕТОК ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА ПРИ ЗАМОРАЖИВАНИИ
© 2015 г. Д. С. Лаптев1, Т. В. Полежаева1, О. О. Зайцева1, А. Н. Худяков1, С. В. Утемов2, М. Г. Князев2, А. А. Костяев2
1ФГБУНИнститут физиологии Коми научного центра Уральского отделения РАН 2ФГБУН "Кировский НИИ гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства"
E-mail: lapden@mail.ru Поступила в редакцию 18.09.2013 г.
Предложен новый способ консервирования ядросодержащих клеток в электрическом холодильнике с использованием ксенона. После суточного криоанабиоза (—80°С) при медленном охлаждении биообъекта более 60% лейкоцитов обладает устойчивой к витальному красителю клеточной мембраной, у 85% гранулоцитов сохраняется исходный уровень лизосомально-катионных белков, снижается интенсивность перекисного окисления липидов и активность ферментативных систем, регулирующих содержание перекисей. Криоконсервирование биообъектов в среде инертных газов является перспективным направлением в практической медицине и может стать альтернативным способом традиционному способу с использованием жидкого азота.
Ключевые слова: лейкоциты, ксенон, функциональное состояние, низкая температура —80°С.
Б01: 10.7868/80131164615020101
В условиях снижающейся температуры окружающей среды в клетках происходят структурно-функциональные изменения, при которых в первую очередь нарушаются барьерно-транс -портные свойства биомембран. В силу своей динамической структуры мембраны подвергаются модификации также при появлении чужеродных молекул, в частности, криопротекторов [1]. Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что уже на подготовительном этапе криоконсервирования — эквилибрации клеток в криозащитных средах — происходит существенное замедление транспорта важнейших метаболитов (аминокислот, нуклеозидов) и катионов (№+, ЯЪ+, Са2+) в клетке. В последующем, даже в условиях криопротекции и при использовании щадящих режимов замораживания — отогрева в биомембранах, происходит формирование трансмембранных микродефектов, образование которых существенно снижается, если в качестве ограждающей среды используются вещества, замерзающие в виде гидратов: глицерин, холинхло-рид, сахароза, №С1, ЫС1 и др. [2].
Инертные газы также обладают способностью образовывать с молекулами клеточной воды гид-ратные соединения [3]. Газовые гидраты принадлежат к типу клатратов и представляют собой
рыхлые кристаллические структуры, не являющиеся льдом. Они вписываются во внутриклеточную архитектуру клеток, не повреждая мембран. Показано [3], что при появлении в биологических клетках зародышей льдообразования в виде кла-тратных структур эти микрочастицы сами становятся инициаторами кристаллизации свободной воды. Процесс кристаллизации идет от начала до конца сразу по всему объему охлаждаемого объекта, не нарушая клеточных мембран. С 1999 года в России анестезиологами используется ксенон, который в отличие от большинства анестетиков не обладает токсичностью, не влияет на репродуктивную функцию, не имеет аллергизирующих и канцерогенных свойств, но оказывает иммуностимулирующее действие [4, 5]. При замораживании (— 196°С) кардиомиоцитов мышей в смеси ксенона с кислородом с помощью электронной микроскопии показана эффективная сохранность митохондрий клеток [6]. Однако не выяснена возможность применения ксенона для крио-консервирования клеток организма человека.
Целью настоящей работы явилось изучение функционального потенциала ядросодержащих клеток периферической крови человека при замораживании до —80°С в среде ксенона.
110
ЛАПТЕВ и др.
Устройство для консервирования клеточных взвесей замораживанием под давлением в атмосфере инертного газа — портативный криобароконтейнер: 1 — передняя панель (вид снаружи); 2 — задняя панель (вид изнутри); 3 — вставленный в углубление пластикат-ный контейнер "Компопласт" 300.
МЕТОДИКА
Объектом исследования служили ядросодер-жащие клетки периферической крови человека, полученные из цельной донорской крови методом цитафереза на центрифуге "8огуеП" (США) со скоростью 2500 об/мин. Средний возраст доноров составлял 32 ± 4 года.
В работе использован ксенон, который по совокупности химико-физических характеристик является приемлемым для криоконсервирования. Он хорошо растворяется в воде, легко проникает внутрь клетки, а его клатратные соединения устойчивы при 0°С и 1.5 атм [3]. После деконсер-вации ксенон легко удаляется из клеточной взвеси. Оптимальным для клинической практики является применение медицинского ксенона, содержащего минимальное количество примесей. В настоящей работе использован ксенон высокой чистоты (99.9995%) марки 5.5 компании ООО "НИИКМ" (Россия).
Образованные при комнатной температуре соединения ксенона с молекулами свободной воды приобретают устойчивое состояние при отрицательных температурах, стабильная кристаллизация большинства фракций воды в клетках (исключение составляет фиксированная фракция, замерзающая при —196°С) отмечается при —80°С [7]. Это обосновало выбор используемой в работе отрицательной температуры.
В пластикатный контейнер "Компопласт" с лейкоцитным концентратом, помещенным в разработанный (заявка на изобретение РФ) металлический криобароконтейнер (рисунок), нагнетали ксенон под давлением 6 атм, экспонировали при
комнатной температуре 20 мин. Затем давление стравливали до атмосферного, "Компопласт" с биообъектом извлекали из криобароконтейнера и замораживали [8] в течение 15 мин в хладагенте (96% этиловый спирт) при —28°С в электрическом морозильнике "Derby" (Дания), затем переносили для дальнейшего замораживания и хранения в воздушную среду электроморозильника на —80°С MDF-3086S "Sanyo" (Япония). Деконсер-вировали клетки через одни сутки в 20-литровой водяной ванне при температуре +38°С в течение 35—50 секунд при интенсивном покачивании контейнера (2—3 раза в секунду) до температуры биообъекта +3 ± 1°С. При —80°С в клетках наблюдается глубокое замедление метаболизма, в связи с чем срок хранения не является лимитирующим фактором повреждений биообъекта. Необратимые изменения возможны на этапах замораживания и отогрева. В связи с этим срок экспозиции в данной работе составил 1 сутки.
О степени жизнеспособности клеток судили по параметрам, приведенным в работе [9]: устойчивости клеточной мембраны лейкоцитов к су-правитальному красителю трипановому синему Н "Sigma" (США); степени популяционной стабильности и сохранности общего количества лейкоцитов с помощью метода световой микроскопии (Nikon H550S); содержанию соединений, обеспечивающих микробицидность нейтрофилов без участия кислорода (дефензины, серпроциди-ны, кателицидин) в лизосомально-катионном тесте по методике А.А. Славинского и Г.В. Никитиной; интенсивности процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в мембранах нейтро-филов и активности ферментативных систем, регулирующих уровень перекисей в этих клетках, т.е. определяли антиоксидантную активность (АОА) методом индуцированной хемилюминес-ценции на биохемилюминометре БХЛ-07 (ЦНИЛ НГМА; "ИМБИО", Россия).
При статистической обработке данных вычисляли среднее арифметическое значение ± среднее квадратичное отклонение (M ± 5). Для выявления статистической значимости различий (p < 0.05) между группами применяли непараметрический критерий Вилкоксона [10] с использованием компьютерной программы для медико-биологической статистики "BIOSTAT".
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
При изучении влияния ксенона на показатели жизнеспособности клеток (общее количество и популяционный состав, проницаемость мембраны) в условиях комнатной температуры статистически значимых различий не выявлено.
ВЛИЯНИЕ ИНЕРТНОГО ГАЗА КСЕНОНА НА ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ
111
Показатели хемилюминограммы лейкоцитов после 20 минут экспозиции в среде ксенона (6 атм) и после декон-сервирования (п = 18, М ± ст)
Объект Показатели
Imax S tg(—2a)
Лейкоциты 162.1 ± 31.6 949.6 ± 184.7 44.8 ± 11.9
Лейкоциты с ксеноном 158.4 ± 36.9 997.1 ± 221.7 41.6 ± 12.0
Лейкоциты с ксеноном после отогрева 114.4 ± 17.7* 754.9 ± 95.7* 29.9 ± 6.7*
* Различие с величиной показателя лейкоцитов с ксеноном статистически значимо (р < 0.05).
Анализ полученных хемилюминограмм показал, что у лейкоцитов в среде ксенона до замораживания уровень интенсивности ПОЛ и АОА не изменяются (таблица). Однако в первые минуты после отогрева отмечается совместное и равнозначное снижение данных показателей, что, возможно, связано с постепенным удалением газа из клеточной взвеси и медленным восстановлением процессов метаболизма в отогретых клетках.
Оценка целостности плазматической мембраны лейкоцитов с витальным красителем трипано-вым синим показала, что после деконсервирова-ния неповрежденной мембраной обладает 64.5 ± ± 14.4% клеток от исходного уровня (п = 5, М± а). Морфологическая сохранность гранулоцитов, как наиболее лабильной популяции лейкоцитов, составляет 86.0 ± 11.0%. Высокие показатели обусловлены оптимальным сочетанием медленного замораживания и быстрого отогрева биообъекта [8].
Содержание микробицидных белков в нейтро-филах, насыщенных ксеноном, после суточного хранения при —80°С не изменяется. Исходный уровень среднего цитохимического коэффициента составляет 2.5 ± 0.7 усл. ед., после отогрева — 2.3 ± 3.8 усл. ед. (п = 5, М± а). Это указывает на сохранность мембран лизосом, чувствительных к стресс-воздействию.
Полученные данные свидетельствуют о том, что насыщение ксеноном клеточной взвеси перед криоконсервированием позволяет клеткам подготовиться к холодовому воздействию. Ксенон вследствие высокой растворимости в липидах клеточных мембран изменяет их проницаемость для ионов, а образование клатратов со свободной внутриклеточной водой уменьшает подвижность ее молекул и белков, чем дополнительно снижает скорость обменных процессов лейкоцитов [11]. Кроме того, образование рыхлых газовых гидратов при снижении температуры с одновременной кристаллизацией всего биообъекта, отсутствием град
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.