РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2009, ТОМ 3(12), № 3-4, с. 294-302
ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
ВЛИЯНИЕ ИНГИБИТОРА ЦИКЛООКСИГЕНАЗЫ НА ОПОСРЕДОВАННУЮ ЧЕРЕЗ TLR2 И TLR4 ВЫРАБОТКУ ЦИТОКИНОВ МОНОНУКЛЕАРНЫМИ КЛЕТКАМИ ЧЕЛОВЕКА В НОРМЕ И ПРИ ОСТРОМ ПАНКРЕАТИТЕ
© 2009 г. М.В. Хорева, Л.В. Ковальчук, А.С. Варивода, В.В. Греченко, М.А. Агапов, В.А. Индароков, И.В. Леоненко, В.А. Горский
ГОУ ВПОРоссийский государственный медицинский университет, Росздрава, Москва, Россия
Поступила: 28.07.2009. Принята: 05.08.2009
Целью данной работы было изучить влияние ингибитора циклооксигеназы (ЦОГ) — лорноксикама на выработку цитокинов, опосредованную лигандами Toll-подобных рецепторов (TLR), мононуклеарными клетками (МНК) периферической крови здоровых доноров in vitro и у больных с острым деструктивным панкреатитом в динамике заболевания. Выработку цитокинов МНК здоровых доноров in vitro стимулировали лигандами TLR: липополисахаридом (ЛПС) и пептидогликаном (ПГ). Лорноксикам достоверно ингибирует выработку как провоспалительных (ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-12, ФНОа), так и противовоспалительного (ИЛ-10) цитокина, ассоциированных с TLR1/2 и TLR4 МНК периферической крови здоровых доноров. У больных с острым деструктивным панкреатитом в сыворотке крови повышен уровень провоспалительных цитокинов (ИЛ-6 и ИЛ-8), концентрация ИЛ-6 и ИЛ-8 выше у больных с тяжелым течением заболевания. Проведение терапии с использованием лорноксикама приводит к достоверному снижению ИЛ-6 и ИЛ-8 к 6 суткам заболевания. У больных в группе сравнения к 6 суткам уровни ИЛ-6 и ИЛ-8 увеличиваются. Лиганды TLR1/2 (ПГ) и TLR4 (ЛПС) обладают выраженным стимулирующим действием in vitro на выработку ФНОа МНК, полученными в 1 сутки от начала заболевания при проведении стандартной базисной терапии. Увеличение индуцированной выработки цитокина свидетельствует о повышенной функциональной активности TLR2 и TLR4 у этих больных. К 6-м суткам стимулирующее влияние лигандов оставалось высоким. В основной группе больных, получающих лечение лорноксикамом, выявили, что стимулирующее влияние ПГ снижается и восстанавливается до значений сравнимых с группой здоровых доноров к 6 суткам. Таким образом, лорноксикам, как ингибитор циклооксигеназы, подавляет также выработку провоспалительных цитокинов МНК периферической крови здоровых доноров и больных с острым панкреатитом.
Ключевые слова: Toll-подобные рецепторы, цитокины, острый панкреатит, ингибитор циклооксигеназы
ВВЕДЕНИЕ
В последние годы большое внимание уделяется изучению рецепторов врожденного иммунитета, в частности, То11-подобных рецепторов (ТЬИ), их роли в патогенезе имму-ноопосредованных заболеваний человека, развитии воспаления [1, 2]. ТЬИ относятся к паттерн распознающим рецепторам (ПРР), участвующим в распознавании консерва-
Адрес: 127540 г. Москва, ул. Островитянова, д. 1, РГМУ. E-mail: markhoreva@yandex.ru
тивных молекулярных структур микроорганизмов, так называемых РАМР (паттерны, ассоциированные с микроорганизмами). Активация этих рецепторов запускает внутриклеточные каскады, приводит к экспрессии транскрипционных факторов ЫБ-кВ, ШБ-3/7, индукции выработки широкого спектра провоспалительных цитокинов (ФНОа, ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-12, ИФНа/р и других), развитию реакций врожденного иммунитета, контролю воспалительной реакции [3, 4].
Лиганды, активирующие ТЬИ, имеют экзогенное происхождение, например, компоненты клеточной стенки бактерий: пептидогли-
каны, липополисахариды (ЛПС), флагеллин, ДНК микроорганизмов, вирусная РНК и многие другие. Выявлены также лиганды эндогенного происхождения, получившие обозначение как «сигналы опасности» или DAMP (от англ. damage-associated molecular pattern), такие как белки теплового шока (HSP60, HSP70, фибронектин и многие другие) [5, 6]. При массивном повреждении тканей, стрессовых воздействиях, в результате гибели большого количества собственных клеток организма происходит высвобождение значительных концентраций эндогенных лигандов, что приводит к активации сигнальных путей TLR. Иногда DAMP связывают с так называемым «стерильным воспалением», которое развивается в ответ на травму, ишемию, массивное тканевое повреждение и т.д. при отсутствии патогенной инфекции и сопровождается высокой выработкой провоспалительных цитокинов. Некоторые DAMP молекулы или алармины могут секретироваться из активированных лимфоцитов в ответ на воздействие микробных компонентов или цитокинов [5]. При многих воспалительных заболеваниях, сопровождающихся массивной клеточной деструкцией, активацией клеток иммунной системы, в частности при остром панкреатите, оба варианта лигандов могут оказывать синергетическое действие и таким образом, усиливать выработку провоспалительных ци-токинов. В связи с этим крайне важной становится задача поиска лекарственных средств, блокирующих повышенную функцию рецепторов врожденного иммунитета.
На кафедре иммунологии РГМУ в последние годы проводятся исследования по изучению роли TLR при острых патологических состояниях [7, 8]. Мы выявили, что при остром инфаркте миокарда (ОИМ) повышена спонтанная и стимулированная лигандами через TLR2 и TLR4 выработка ФНОа моно-нуклеарными клетками (МНК) периферической крови больных на 1 сутки заболевания. Дальнейшее увеличение индуцированной выработки цитокина у больных к 14 суткам заболевания приводило к развитию осложнений, служило прогностическим признаком неблагоприятного исхода заболевания [7]. Таким образом, длительная активация TLR приводит к накоплению избыточных количеств провос-палительных цитокинов, в частности ФНОа, который может оказаться фактором тканевого повреждения, способствующим развитию осложнений основного заболевания.
Острый панкреатит (ОП) — локальное воспаление ткани поджелудочной железы, которое сопровождается в той или иной степени выраженной системной воспалительной реакцией [9]. На сегодняшний день известно, что ведущую роль в патогенезе острого панкреатита играют медиаторы воспаления: про-воспалительные цитокины, такие как ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8 и ФНОа, а также циклооксигеназа (ЦОГ) и другие медиаторы [10]. Гепаран сульфат и панкреатическая эластаза могут приводить к активации TLR4, выбросу провоспалительных цитокинов, что впоследствии может усугубляться при присоединении инфекции [11]. Чрезмерная активация иммунной системы, гиперпродукция провоспалительных ци-токинов («цитокиновый шторм») на первой неделе заболевания могут привести к развитию системной воспалительной реакции, повреждению тканей и, в особо тяжелых случаях, полиорганной недостаточности [9].
Идет активный поиск лекарственных средств, подавляющих TLR-опосредованные сигнальные пути [12]. Лорноксикам — нестероидный противовоспалительный препарат группы оксикамов. Принципиальный механизм его действия заключается в ингибиро-вании ЦОГ, ключевого фермента метаболизма арахидоновой кислоты. Под влиянием лорноксикама подавляются синтез проста-гландинов (ПГ), выработка активных форм кислорода лейкоцитами и другие механизмы воспалительного процесса [13]. Недавно показано, что лорноксикам ингибирует активацию NF-kB фактора транскрипции [14].
В связи с изложенным, целью данной работы является изучение влияния ингибитора ЦОГ — лорноксикама на выработку про-воспалительных и противовоспалительных цитокинов, опосредованную лигандами Toll-подобных рецепторов мононуклеарными клетками (МНК) периферической крови здоровых доноров in vitro, и у больных с острым панкреатитом.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследование проведено на кафедрах иммунологии и экспериментальной и клинической хирургии медико-биологического факультета РГМУ.
Пациенты. В исследование включены 10 здоровых доноров и 11 больных острым деструктивным панкреатитом (ОП) токсической этиологии. Всем пациентам проводилась
Таблица 1. Клиническая характеристика больных
Основная Группа
группа сравнения
Возраст (лет) 40,8±1,3 41±1,4
Мужчин/женщин 4(66,7%)/2 5 (100%)/0
(33,3%) (0%)
Среднетяжелое 3 (50%) 4 (80%)
течение ОП
Тяжелое течение 3 (50%) 1 (20%)
ОП
Острая почечная 1 (17%) 1 (20%)
недостаточность
Печеночно-кле- 1 (17%) 1 (20%)
точная недостаточ-
ность
Дыхательная 1 (17%) 1 (20%)
недостаточность
Делирий 3 (50) 1 (20%)
консервативная терапия острого панкреатита, согласующаяся с приказом №181 ДЗ г. Москвы. 6 пациентам основной группы комплексную терапию дополняли НПВС группы окси-камов — лорноксикамом. В основной группе пациентам со среднетяжелым течением заболевания лорноксикам вводился внутривенно, а с тяжелым — в круглую связку печени (лимфотропно). 5 больных группы сравнения получали только стандартную базисную терапию. В основной группе мужчин было 4 (66,7%), женщин — 2 (33,3%); средний возраст составил 40,8 ± 1,3 лет. В группе сравнения все 5 пациентов были мужчины, средний возраст которых составил 41 ± 1,4 лет (таб. 1).
Выделение мононуклеарных клеток. МНК выделяли из гепаринизированной периферической крови (25 ед./1 мл крови) здоровых доноров и больных с острым деструктивным панкреатитом в одноступенчатом градиенте плотности фиколл-урографина («Pharmacia», р = 1,077 г/см3). Клетки культивировали в среде RPMI-1640 (НПП «ПанЭко»), содержащей 5% сыворотки эмбрионов коров («HyClone, Perbio»), 2mM L-глутамина (НПП «ПанЭко») и 100 мкг/мл гентамицина (ОАО «Дальхим-фарм», г. Хабаровск) в течение 24 часов при 37 °С в атмосфере с 5% СО2. Рабочая концентрация клеток составляла 1 х 106 в мл.
Стимуляция клеток. В качестве лигандов TLR использовали следующие стимуляторы: пептидогликан (ПГ) (Staphylococcus aureus, «Sigma/Fluka») 2,5 мкг/мл, ЛПС (E.rali 0127: B8, «Sigma») в дозе 0,1 мкг/мл, действующие через TLR1/2 и TLR4, соответственно. Контролем служили МНК, культивируемые толь-
ко в полной среде RPMI-1640. По окончании культивирования (24 часа) МНК осаждали центрифугированием при 400g в течение 15 минут, получали супернатанты и хранили в течение 2 — 3 месяцев при температуре -70 °С.
Оценка влияния лорноксикама на выработку цитокинов МНК периферической крови здоровых доноров in vitro.
Выработку цитокинов МНК периферической крови здоровых доноров стимулировали лигандами TLR1/2 (ПГ) и TLR4 (ЛПС) в п
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.