НЕЙРОХИМИЯ, 2012, том 29, № 3, с. 235-239
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 616.379-008.64-092+577.151.05
ВЛИЯНИЕ ИНГИБИТОРОВ ПРОТЕИНКИНАЗЫ С НА СОДЕРЖАНИЕ НЕКОТОРЫХ ТРАНСКРИПЦИОННЫХ ФАКТОРОВ И ФАКТОРОВ МОДУЛЯЦИИ АПОПТОЗА В СПИННОМ МОЗГЕ КРЫС ПРИ ДИАБЕТИЧЕСКОЙ НЕЙРОПАТИИ © 2012 г. А. Р. Алавердян*, Г. С. Вартанян
Ереванский Государственный медицинский университет, Республика Армения
Исследовали изменения содержания факторов транскрипции (МР-кБ, Роз), факторов, регулирующих апоптоз (Ьах, Ьс1-х1), а также маркера активности астроглии — глиального фибриллярного кислого белка в спинном мозге крыс при экспериментальном стрептозотоциновом диабете. Показано, что сдвиги концентраций исследуемых факторов, наблюдаемые при диабете, могут быть частично нормализованы после инъекций ингибиторов протеинкиназы С (ПКС) — гидрохлорида хелеритри-на или роттлерина. Полученные данные свидетельствуют о том, что эти соединения можно отнести к перспективной группе препаратов для коррекции диабетической нейропатии. Поскольку не все изоформы ПКС вовлечены в равной степени в патогенез диабетической нейропатии, разработка селективных ингибиторов, специфичных к определенным изоформам ПКС, может повысить их эффективность и снизить вероятность развития побочных эффектов.
Ключевые слова: диабетическая нейропатия, протеинкиназа С, транскрипционные факторы, апоптоз, глия.
ВВЕДЕНИЕ
Диабетическая нейропатия (ДН) является одним из наиболее распространенных осложений диабета, часто сопровождающихся перманентной болью. На протяжении долгих лет первостепенная роль в развитии ДН отводилась нарушениям в периферической сенсорной системе, однако, исследования последних лет продемонстрировали влияние на развитие ДН вторичных изменений в ЦНС [1].
В механизмы возникновения хронической боли при диабете могут быть вовлечены изменения фенотипа периферических сенсорных нейронов вследствие изменений на уровне генной экспрессии. Активация транскрипционного фактора МР-кБ, влияющего на экспрессию ряда белков, рассматривается как результат различных биохимических реакций, в том числе и активации протеинкиназы С (ПКС), что свойственно диабету [2]. Ингибиторы ПКС предотвращают МР-кБ-зависи-мую транскрипцию [3].
Ранее было показано, что активация ПКС приводит к развитию диабетических осложнений [4—6]. Продемонстрирована также связь между активацией ПКС, в частности, изоформы бета 2 ПКС, и развитием ангиопатии, нефропатии, кардиомио-патии [7, 8]. Однако роль ПКС в патогенезе ДН
* Адресат для корреспонденции: 1005 Ереван, ул. Корюна 2, Республика Армения, тел. (374) 94-13-00-30, e-mail: fmharut@yahoo.com.
изучена недостаточно [9]. Согласно выдвигаемой нами гипотезе, именно ПКС, будучи вовлеченной в регуляцию некоторых факторов транскрипции и апоптоза, а также активации глии, является важным молекулярным агентом, связанным с обратимыми и необратимыми нарушениями метаболизма при ДН [10].
Для оценки возможных необратимых изменений при экспериментальном стрептозотоциновом диабете мы определяли концентрацию ключевых транскрипционных факторов NF-kB и Fos, участвующих в патогенезе ДН. С целью исследования возможной роли апоптоза в рассматриваемых процессах нами выбраны следующие факторы: антиа-поптотический фактор bcl-xl и проапоптотиче-ский фактор bax. Для исследования активности глии измеряли уровень маркера астроглии — глиального фибриллярного кислого белка, glial fibrillar acidic protein (GFAP). Исследовали влияние ингибиторов ПКС на концентрацию факторов NF-kB, Fos, bcl-xl и bax, а также GFAP.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Диабет у крыс индуцировали однократной ин-траперитонеальной инъекцией стрептозотоцина в дозе 55 мг/кг в 0.1 М цитратном буфере, рН 4.5. По достижении 4-х недельного срока диабета производили декапитацию под глубокой анестезией, вызываемой интраперитонеальной инъекцией
235
4*
3500000 3000000 2500000 2000000 1500000 1000000 500000 0
ХП.
1400000 1200000 1000000 800000 600000 400000 200000 0
" I
I I
_i_I_I_L_
2 3 4 5 6
6
1
2
3
4
5
1
Рис. 1. Уровень Ьах в спинном мозге при применении гидрохлорида хелеритрина и роттлерина у здоровых (1—3) и у диабетических крыс (4—6). 1. норма; 2. у здоровых крыс после введения гидрохлорида хелеритрина (СИ, р < 0.05 по сравнению с 1); 3. у здоровых крыс после введения роттлерина р < 0.05 по сравнению с 1); 4. у диабетических крыс (р < 0.05 по сравнению с 1); 5. у диабетических крыс после введения гидрохлорда хелеритрина (СИ,р > 0.05 по сравнению с 4); 6. у диабетических крыс после введения роттлерина р < 0.05 по сравнению с 4).
Рис. 2. Уровень Ьс1-х1 в спинном мозге при применении гидрохлорида хелеритрина и роттлерина у здоровых (1—3) и у диабетических крыс (4—6). 1. норма; 2. у здоровых крыс после введения гидрохлорида хелери-трина (СИ, р > 0.05 по сравнению с 1); 3. у здоровых крыс после введения роттлерина р < 0.05 по сравнению с 1); 4. у диабетических крыс (р < 0.05 по сравнению с 1); 5. у диабетических крыс после введения гидрохлорида хелеритрина (СИ,р > 0.05 по сравнению с 4); 6. у диабетических крыс после введения роттлерина р < 0.05 по сравнению с 4).
нембутала из расчета 100 мг/кг массы. После де-капитации определяли уровень глюкозы в крови; диабет констатировали при концентрации глюкозы, превышающей 13 мМ/л. Затем выделяли 3-5-ый люмбарные сегменты спинного мозга и гомогенизировали ткань в лизисном 20 mM Tris-HCl буфере, pH 7.4, содержащем 1—2 mM EDTA, 10 мкг/мл апротинин, 10 мкг/мл лейпептин, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 2% Тритон X-100, 0.1% азид натрия, в соотношении 1 : 10.
С помощью метода вестерн-блоттинг (с использованием комплекта BioRad) определяли уровень белков NF-kB p65, Fos, bax, bcl-xl, pNMDA NR1 и GFAP у здоровых и диабетических крыс через 24 ч после инъекции гидрохлорида хелеритрина (4 мг/кг), уровень белков NF-kB p65, Fos, bax и bcl-xl — у здоровых и диабетических крыс через 24 ч после инъекции роттлерина (2 мг/кг). Декапи-тацию проводили через 24 часа после инъекции ингибиторов ПКС. Уровень Fos и pNMDA NR1 определяли после инъекции в лапку крысы 50 мкл 4% раствора формалина.
Пробы подвергали электрофорезу по системе Лэммли при напряжении 200 В и силе тока 30—70 А, затем разделенные фракции проб из геля переносили на нитроцеллюлозные мембраны (Amer-sham), которые подвергали действию первичных, а затем вторичных антител. Интенсивность сигналов измеряли с помощью усиленной хемилюми-несценции (enhanced chemiluminescence).
Длительность инкубации с антителами против Fos составляла 12 часов, против NF-kB — 4 часа, против bcl-xl — 12 часов, против bax — 12 часов, против GFAP — 24 часа, против NMDA — 24 часа, а со вторичными антителами — 1 час. После инкубации с первичными и вторичными антителами мембраны промывали 50 мМ Трис-HCl буфером,
рН 7.4, содержащим 58.44 г NaCl, 2.5 мл Tween 20 (на 5 л) по 3 раза в течение 5 минут на шейкере с целью удаления несвязанных или слабо связанных антител.
Полученные блоты на рентгеновской пленке сканировали и проводили их количественный анализ с помощью программы Fuji Image Gauge v4. Значения интенсивности сигнала получали в результате вычетания интенсивности фона. Данные были обработаны методом дисперсионного анализа (ANOVA) с использованием пакета GraphPad Prism 4. Для анализа результатов формалинового теста использован метод непараметрического анализа Mann—Whitney. Разница между данными была принята как статистически достоверная в случае p < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Как показали результаты проведенных исследований, у крыс, больных диабетом, экспрессия белка bax была повышена в 7.1 раза по сравнению со здоровыми животными (рис. 1). Интересно, что в то время как гидрохлорид хелеритрина повышал экспрессию bax на 80% у здоровых крыс, роттле-рин, напротив, снижал ее на 17%. У крыс, больных диабетом, гидрохлорид хелеритрина вызывал незначительное снижение экспрессии bax (на 5%, разница статистически недостоверна, p > 0.05), в отличие от роттлерина, который снижал экспрессию bax на 50%.
При диабете уровень белка bcl-xl в спинном мозге крыс был повышен по сравнению с нормой на 40% (рис. 2). У здоровых крыс роттлерин повышал уровень этого белка на 23%. У крыс, больных диабетом, роттлерин повышал его на 32%. Под влиянием гидрохлорида хелеритрина изменения
ВЛИЯНИЕ ИНГИБИТОРОВ ПРОТЕИНКИНАЗЫ С
237
уровня Ьс1-х1 как у здоровых, так и у диабетических крыс не превышали 7% (разница статистически недостоверна,р > 0.05).
При диабете наблюдалось повышение на 33% фоновой экспрессии белка Роз (рис. 3). У здоровых крыс, подвергнутых инъекциям формалина, концентрация Роз повышалась на 58%, а у крыс, больных диабетом, — на 112%. Повышенный после инъекции формалина уровень экспрессии Роз снижался под воздействием роттлерина по сравнению с нормой и составлял 13% (р > 0.05), а под воздействием гидрохлорида хелеритрина — 9%. У диабетических крыс различие между уровнем Роз в контроле и после инъекции формалина под воздействием гидрохлорида хелеритрина уменьшалось до 18%, в то время как влияние роттлерина на фоне действия формалина было незначительным, разница оказывалась статистически недостоверной.
Как известно, уровень белка Роз в спинном мозге характеризирует интенсивность болевой им-пульсации, и чем выше болевая чувствительность, тем выше уровень Роз в спинном мозге [11]. Измеряя уровень Роз в спинном мозге после инъекции стандартного формалинового раствора, можно судить об изменениях болевой чувствительности организма при патологических состояниях, а также об анальгетической эффективности различных препаратов. Механизм подобной корреляции до сих пор не выяснен, однако, Роз, будучи транскрипционным фактором, уровень которого повышается в ответ на болевую стимуляцию, в свою очередь повышает экспрессию ряда белков, в результате чего происходят фенотипические изменения нейронов [12]. При диабете повышение фонового уровня Роз по сравнению с нормой говорит о повышенной болевой импульсации.
Инъекция формалина, вызывающая боль, приводит к повышению уровня Роз у здоровых и диабетических крыс, причем этот эффект более выражен при диабете (58% против 112%). Полученные р
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.