научная статья по теме ВЛИЯНИЕ ИНГИБИТОРОВ RHO- И ТИРОЗИНОВОЙ С-SRC-КИНАЗ НА СЕРОТОНИНИНДУЦИРОВАННОЕ СОКРАЩЕНИЕ АОРТЫ И БРЫЖЕЕЧНОЙ АРТЕРИИ КРЫСЫ Биология

Текст научной статьи на тему «ВЛИЯНИЕ ИНГИБИТОРОВ RHO- И ТИРОЗИНОВОЙ С-SRC-КИНАЗ НА СЕРОТОНИНИНДУЦИРОВАННОЕ СОКРАЩЕНИЕ АОРТЫ И БРЫЖЕЕЧНОЙ АРТЕРИИ КРЫСЫ»

ФИЗИОЛОГИЯ ЖИВОТНЫХ И ЧЕЛОВЕКА

УДК 615.357.03:617-001.36.015.4.076.9

ВЛИЯНИЕ ИНГИБИТОРОВ Rho- И ТИРОЗИНОВОЙ с^гс-КИНАЗ НА СЕРОТОНИНИНДУЦИРОВАННОЕ СОКРАЩЕНИЕ АОРТЫ И БРЫЖЕЕЧНОЙ АРТЕРИИ КРЫСЫ © 2014 г. Л. М. Кожевникова, А. А. Московцев, М. В. Меситов

Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии РАМН, 125315 Москва, ул. Балтийская, 8

E-mail: lubovmih@yandex.ru Поступила в редакцию 04.02.2014 г.

Установлено, что ингибитор Rho-киназы фасудил избирательно подавляет сокращение изолированных колец аорты и брыжеечной артерии крысы на воздействие агонистов 5НТ2А- (DOI и TBC-2) и 5НТ1А-рецепторов (8-OH-DPAT) и не влияет на вазоконстрикцию, вызванную серотонином. Впервые показано, что воздействие агонистов 5НТ2С-рецепторов (МК 212 и SCH 23390) не оказывает влияния на тонус "интактных" сосудов. Выраженный вазоконстрикторный эффект агонистов 5НТ2С-рецепторов проявляется при их действии на предсокращенные ангиотензином II или вазо-прессином сосуды. Получены данные об отсутствии негативного влияния ингибитора Rho-киназы на МК 212- и SCH 23390-индуцированное сокращение изолированных колец аорты и брыжеечной артерии крысы. Предполагается, что в присутствии фасудила сокращение сосудов в ответ на воздействие серотонина реализуется через 5НТ2С-рецепторы, передача сигнала от которых осуществляется по механизму, не зависящему от активности Rho-киназы. Показано, что фасудил на 40% уменьшает вазоконстрикцию, индуцированную норадреналином и вазопрессином. Установлено, что важнейшую роль в механизмах трансдукции сигнала от вазоконстрикторных 5НТ-рецепторов играет тирозиновая с-$гс-киназа, действие которой специфично по отношению к вазоконстрикторным 5НТ-рецепторам.

DOI: 10.7868/S0002332914050063

Нарушения работы рецепторов и управляемых ими регуляторных систем в клетках кровеносных сосудов — причина развития многих заболеваний сердечно-сосудистой системы, а выяснение молекулярных механизмов нарушения сигнальной трансдукции — необходимое условие для понимания их патогенеза. Роль периферической серото-нинергической системы в регуляции сосудистого тонуса изучена недостаточно. Многообразие ответов на действие серотонина (5НТ) обусловлено наличием 7 типов и >15 видов 5НТ-рецепторов, локализованных в различных структурах головного мозга, в гладкомышечных и эндотелиальных клетках сосудов, в кардиомиоцитах и т.д. (Davis et al., 2012; Watts et al., 2012). Накапливается все больше данных о причастности 5НТ-рецепторов к развитию гипертензивных состояний, в том числе к гипертензии легочных артерий (Watts, 2005; MacLean, 2007; Zhang et al., 2008; MacLean, Dempsie, 2010).

В последние годы особое внимание стали уделять определению роли цитоплазматических белков, которые непосредственно взаимодействуют с внутриклеточными фрагментами 5НТ-рецепторов и участвуют в формировании сложного функционального комплекса — рецепторосомы (Bockaert

et al., 2004; Armbruster, Roth, 2005). Эти белки могут не только контролировать локализацию 5НТ-рецепторов на клеточной мембране, их транспорт и метаболизм, но и определять связывание рецепторов с тем или иным G-белком и таким образом влиять на их сигнальную функцию (Hall, Lefkowitz, 2002; Gavarini et al., 2004). К числу ассоциированных с 5НТ-рецепторами белков относятся кальмодулин (Turner et al., 2004; Turner, Roymond, 2005; Labasque et al., 2008; Dai et al., 2011), тирозиновые с-8гс-киназы (Lu et al., 2008; Magalhaes et al., 2012), Rho-белок (Raymond et al., 2006; Estévez et al., 2008) и PDZ-белки (Becamel et al., 2004; Lin et al., 2012). Значение этих белков в реализации функциональной активности 5НТ-рецепторов в сосудах и в механизмах их взаимодействия с рецепторами других вазоактивных соединений до настоящего времени мало изучено.

Ранее мы показали, что важнейшим вторичным посредником передачи сигнала от вазокон-стрикторных 5НТ-рецепторов является кальмодулин (Кожевникова, Авдонин, 2012). Блокаторы кальмодулина избирательно прерывают кальциевый сигнал от вазоконстрикторных 5НТ-рецеп-торов на начальном звене сигнального каскада на уровне взаимодействия рецепторной молекулы с

G-белками. Наряду с основным Са2+-зависимым механизмом большое значение в регуляции тонуса кровеносных сосудов имеют Са2+-независи-мые механизмы, связанные с развитием сенсити-зации сократительных белков к ионам Са2+ (Hira-no, 2007). Важную роль в Са2+-независимой регуляции сократимости кровеносных сосудов играет небольшой GTP-связывающий Rho-белок (GTPaseRho), эффектором которого является Rho-киназа (Somlyo, Somlyo, 2003). Помимо Rho-киназы важнейшим компонентом сигнальных каскадов, активируемых 5НТ, является широко представленная в различных тканях тирозоновая Src-киназа (Watts et al., 2001; Nagaoka el al., 2006; Lu et al., 2008). Из большого семейства тирозино-вых Src-киназ в сосудистой стенке локализована главным образом с^гс-киназа (Oda et al., 1999). Показано, что с^гс-киназа играет важную роль в механизмах клеточной сигнализации в различных тканях, в том числе в эндотелиальных и глад-комышечных клетках, что позволяет рассматривать данный фермент в качестве потенциального регулятора тонуса кровеносных сосудов (Alioua et al., 2002; Wong et al., 2005; Ogden et al., 2006; Lu et al., 2008).

Цель эксперимента — изучение роли Rho- и с^гс-киназ в реализации эффекта от вазокон-стрикторных 5НТ-рецепторов и регуляции тонуса кровеносных сосудов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена на изолированных фрагментах аорты и брыжеечной артерии крыс-самцов породы Wistar массой 200—250 г. В качестве наркоза использовали 25%-ный раствор уретана (4 мл/кг). Крыс декапитировали, выделяли грудной отдел аорты и брыжеечную артерию, которые помещали в охлажденный физиологический раствор Кребса—Хенселейта. Сосуды очищали от жировой и соединительной тканей и нарезали на кольца шириной 1.5—2 мм, которые крепили на держателях, помещенных в раствор Кребса-Хен-селейта (37°С), аэрируемый карбогеном (смесь О2 : СО2 = 95 : 5%). Силу сокращения изолированных фрагментов сосудов измеряли в изометрическом режиме.

Для оценки функционального состояния сосудов на них воздействовали агонистом а-адрено-рецепторов — норадреналином (NA) (Sigma, США). После подъема кривой тонического сокращения в ответ на воздействие NA к сосудам добавляли не гидролизируемый ацетилхолинэс-теразами аналог ацетилхолина — карбахол (Sigma). Расслабление сосуда более чем на 50% свидетельствовало о целостности эндотелиального слоя. Оценивали влияние ингибитора Rho-киназ

HA-1077 dihydrochloride (фасудил, ФАС) (Sigma) на сократимость сосудов в ответ на воздействие: 5НТ, агонистов 5НТ1А-рецепторов — (±)-8-hy-droxy-2-dipropylaminotetralin hydrobromide (8-OH-DPAT) (Tocris, США); 5НТ2А-рецепторов -DO I hydrochloride (Sigma) и TBC-2 (Tocris); 5НТ2С-рецепторов — SCH 23390 hydrochloride и МК 212 (Tocris); агонистов 5НТ1В- и 5НТ2В-ре-цепторов — соответственно CGS 12066В и BW723C86 (Sigma). Для сравнения исследовали влияние ФАС на сокращение сосудов, вызванное воздействием NA, аргининвазопрессина (AVP) и ангиотензина II (ATII) (Sigma).

Изучали влияние ингибитора тирозиновой с^гс-киназы 3-(4-chlorophenyl) 1-(1,1-dimethyl-ethyl)-1#-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine (РР2, Tocris) на 5НТ-индуцированное сокращение колец аорты. В качестве контроля использовали его неактивный аналог 1-phenyl-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimi-din-4-amine (РР3, Tocris). Время инкубации изолированных фрагментов аорты или брыжеечной артерии крысы с ингибиторами Rho- и с^гс-ки-наз составляло 20 мин. После этого оценивали характер изменения сократительного ответа на воздействие вазоактивных соединений. Для оценки влияния ингибитора тирозиновой с^гс-киназы на G-белокзависимую передачу сигнала использовали активатор G-белков фторалюминат (10 мМ NaF в присутствии 20 мкМ AlCl3). Статистическая обработка данных проводилась с использованием i-критерия Стьюдента. Различия между показателями считали достоверными при p < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Установлено, что в присутствии ингибитора Rho-киназ ФАС (2 х 10-6 М) в ответ на воздействие агониста 5НТ2А-рецепторов Э01 (10-6 М) прирост силы сокращения изолированных колец аорты уменьшается более чем в 5 раз по сравнению с реакцией сосудов в отсутствие ФАС (рис. 1а). Отмечено, что после отмывки от ФАС и Э01 кольца аорты крыс начинают вновь сокращаться. При этом прирост силы сокращения сосудов такой же, как и при воздействии на них агониста 5НТ2А-рецепторов в отсутствие ингибитора Rho-киназ (рис. 1б), что может косвенно свидетельствовать о прочном взаимодействии агониста с рецепторной молекулой, а также о том, что ингибирование Rho-киназ ФАС — быстрооб-ратимый процесс. Аналогичные результаты были получены и при использовании более селективного по сравнению с Э01 агониста 5НТ2А-рецеп-торов ТВС-2. В отсутствие ФАС воздействие ТВС-2 (5 х 10-7 М) на изолированные фрагменты аорты крысы приводит к выраженному и стойко-

Рис. 1. Влияние ингибитора КИо-киназ фасудила на агонист-индуцированное сокращение изолированных колец аорты. а — сила сокращения в ответ на воздействие агонистов 5НТ1А- и 5НТ2А-рецепторов (соответственно 8-ОН-ВРДТ и ТВС-2, ВО1), а также серотонина (5НТ), эндотелина-1 (ЕТ1), аргининвазопрессина (ДУР) и норадреналина (N4) в отсутствие (1) и в присутствии (2) фасудила. б, в — кинетика сокращения изолированных колец аорты в ответ на воздействие агонистов 5НТ2А-рецепторов ВОТ (б) и ТВС-2 (в) в отсутствие и в присутствии фасудила. * — р < 0.01.

120

и

15 80 я

св

р

м о о св Ч

и

О

40

а1 а 2

(а)

БО1 ТВС-2 8-ОН-БРДТ 5НТ

(б) Отмывка I

ЕТ1 (в)

ДУР

Отмывка

МД

*

*

*

0

му увеличению силы их сокращения, в то время как в присутствии ингибитора вазоконстриктор-ная реакция сосудов на добавление агониста либо отсутствовала, либо была значительно сниженной и кратковременной (рис. 1в). После отмывки сосудов от ФАС и ТВС-2, как и в случае с применением ЭО1, в большинстве экспериментов кольца аорты без какого-либо дополнительного воздействия вновь сокращались (рис. 1б, в).

В присутствии ингибитора КИо-киназ вазокон-стрикторная реакция аорты подавлялась в ответ на воздейс

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком