РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2013, том 53, № 6, с. 620-624
- УФ-ОБЛУЧЕНИЕ
УДК [57+61]::539.1.04:577.113:612.112.94:614.875
ВЛИЯНИЕ ИНКУБАЦИИ В ГИПЕРТОНИЧЕСКИХ РАСТВОРАХ ХЛОРИДА НАТРИЯ НА ПОВРЕЖДАЕМОСТЬ ДНК ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА ДЛИННОВОЛНОВЫМ УФ-ИЗЛУЧЕНИЕМ
© 2013 г. Н. М. Сметанина1, М. В. Пустовалова2, А. Н. Осипов2*
1 Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, Москва 2 Федеральный медицинский биофизический центр им. А.И. Бурназяна ФМБА России, Москва
Исследовано влияние инкубации в гипертонических растворах NaCl (0.2; 0.35 и 0.5 моль/л в течение 1 ч при температуре 4°C) на выход однонитевых разрывов (ОР) и щелочнолабильных сайтов (ЩС) ДНК, индуцированных длинноволновым УФ-излучением (365 ± 10 нм) в лимфоцитах периферической крови человека in vitro. Показано, что по сравнению c эффектами в клетках, инкубированных в изотоническом растворе NaCl (0.14 моль/л), статистически достоверное увеличение выхода как спонтанных (~ в 1.5—1.9 раза), так и индуцированных УФ-A излучением повреждений ДНК (~ в 1.6—1.7 раза) наблюдается только при концентрации NaCl 0.5 моль/л. Предполагается, что при этой концентрации NaCl происходит диссоциация линкерного гистона Н1, нарушается структура хроматина и резко увеличивается выход свободно-радикальных повреждений ДНК.
Повреждения ДНК, метод ДНК-гало, метод ДНК-комет, ультрафиолетовое излучение, гипертонические растворы, хлорид натрия, лимфоциты.
DOI: 10.7868/S0869803113060155
Основное внимание исследователей биологических эффектов ультрафиолетового (УФ) излучения долгие годы было сосредоточено на коротковолновом (менее 280 нм) излучении, вызывающем серьезные повреждения ДНК и других макромолекул, но почти полностью поглощаемого озоновым слоем земли. УФ-излучение с длинами волн 315—400 нм (согласно международной классификации — УФ-А), более 90% которого достигает земной поверхности, считалось относительно безвредным. В последние десятилетия было показано, что УФ-А излучение, обладающее большой проникающей способностью и воздействующее на глубокие слои кожи, может индуцировать развитие злокачественных новообразований [1—2]. В отличие от коротковолнового и средневолнового (280—315 нм), УФ-А излучение слабо поглощается ДНК и индуцирует повреждения ее структуры преимущественного через генерацию активных форм кислорода и азота [3—4]. Таким образом, при воздействии УФ-А излучения помимо минорной индукции таких фотопродуктов как циклобутановые пиримидиновые димеры образуется большое количество модифицированных оснований и однонитевых разрывов ДНК [5].
Как правило, при рассмотрении клеточной защиты от повреждающего действия активных
* Адресат для корреспонденции: 123182 Москва, ул. Живописная, 46, ФМБЦ им. А.И. Бурназяна ФМБА России; тел.: (499) 190-96-83; е-шаП: andreyan.osipov@gmail.com.
форм кислорода и азота основное внимание обращают на механизмы нейтрализации/детоксика-ции свободных радикалов, в которые вовлечены ферменты (супероксиддисмутаза, каталаза, глу-татионпероксидаза и др.), хелаторы редокс-ак-тивных металлов, низкомолекулярные антиокси-данты (витамины Е и С, каротин, глутатион и др.), белки с высоким содержанием 8И-групп (например, металлотионеины) и т.д. [6]. Гораздо меньше внимания обращают на конформацион-ную защиту хроматина. В то же время хорошо известно, что активный хроматин (эухроматин) в большей степени повреждается свободными радикалами, чем неактивный (гетерохроматин) [7]. Это обусловлено тем, что активно транскрибируемые последовательности не защищены от атак свободных радикалов структурными белками хроматина. Основой процесса самоорганизации хроматина являются слабые взаимодействия его базовых структурных компонентов — ДНК и белков. Изменение ионной силы, например, с помощью гипертонических растворов №С1, приводит к нарушению этих взаимодействий и депротеи-низации хроматина [8]. Использование растворов №С1 с постепенно повышающейся тоничностью позволяет проводить своеобразное, ступенчатое "раздевание" хроматина: при концентрации №С1 0.35 моль/л происходит диссоциация неги-стоновых белков; 0.5—0.6 моль/л — негистоновых белков и линкерного гистона; 1.2 моль/л — неги-стоновых белков, линкерного гистона и коровых
ВЛИЯНИЕ ИНКУБАЦИИ В ГИПЕРТОНИЧЕСКИХ РАСТВОРАХ ХЛОРИДА НАТРИЯ
621
гистонов Н2А-Н2В; 2 моль/л — полная депротеи-низация хроматина [9]. Использование этого подхода позволяет изучать роль конформации хроматина в защите ДНК от повреждающего действия свободных радикалов.
Цель нашей работы состояла в изучении влияния гипертонических растворов NaCl, вызывающих частичную депротеинизацию хроматина, на выход однонитевых разрывов (ОР) и щелочнола-бильных сайтов (ЩС) ДНК, индуцированных УФ-А излучением в лимфоцитах периферической крови человека in vitro.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Для исследований использовалась кровь физически здоровых мужчин-доноров в возрасте 21—28 лет. Забор периферической крови проводили в К2ЭДТА-вакутейнеры ("Vacuette"). У всех доноров было получено согласие на проведение данного исследования.
Выделение лимфоцитов крови человека проводили путем центрифугирования в градиенте плотности фиколл-верографин ("Histopaque", "Sigma-Aldrich") в соответствии с прилагаемой инструкцией. После выделения лимфоциты отмывали и ресуспензировали в фосфатно-солевом буфере до конечной концентрации 1 х 106 клеток/мл.
Суспензию клеток в объеме 200 мкл смешивали с 600 мкл 1%-ного раствора легкоплавкой ага-розы (тип IV) в фосфатно-солевом буфере (рН 7.4) при температуре 37.5°С. Полученную смесь (60 мкл) наносили на предварительно покрытые слоем 1%-ной нормоплавкой агарозы предметные стекла, накрывали покровными стеклами и оставляли на 10 мин при 4°C до образования плотного геля.
Полученные агарозные слайды с иммобилизи-рованными в них клетками (далее агарозные слайды) инкубировали 1 ч при 4°С в фосфатно-солевом буфере (рН 7.4), содержащем NaCl в разных концентрациях (0.14; 0.2; 0.35; 0.5 моль/л).
Для УФ-облучения использовали установку BLX-365 ("Bio-Link"), длина волны 365 ± 10 нм. Облучение проводили при 4°С в дозах 10 и 20 кДж/м2. Интенсивность излучения — 2.92 кДж/м2 за 1 мин.
Анализ однонитевых разрывов ДНК и щелоч-нолабильных сайтов проводили с использованием двух методов.
1) Метод ДНК-комет в щелочных условиях [10, 11]. Коротко: сразу после облучения агароз-ные слайды переносили в холодный (4°C) лизи-рующий буфер (2.5 моль/л NaCl, 100 ммоль/л Na2EDTA, 20 ммоль/л Tris-HCl, pH 10.0, 1% Triton X-100 и 10% DMSO) и выдерживали в течение 1 ч в темноте при 4°C. После лизиса клеток слайды
помещали в холодный (4°C) щелочной раствор (300 ммоль/л NaOH, 1 ммоль/л EDTA, рН > 13) и выдерживали 20 мин для расплетания (щелочной денатурации) нитей ДНК. Электрофорез проводили в щелочном буфере при напряжении 0.75 В/см при комнатной температуре в течение 20 мин. После электрофореза проводили нейтрализацию для ренатурации (восстановления на-тивности) ДНК (3-кратная промывка в 0.4 моль/л Трис-НО буфере, рН 7.4). После чего слайды слегка подсушивали и фиксировали в 70%-ном этаноле в течение 10 мин. Для окраски ДНК использовали SybrGreen I ("Invitrogen"). Визуализацию ДНК-комет проводили с помощью люминесцентного микроскопа Axioscop-40 FL ("Carl Zeiss", Германия) и видеосистемы на основе цифровой камеры MRс 5 ("Carl Zeiss") с программой AxioVision 4.8 ("Carl Zeiss"). На каждом слайде регистрировали по 100 комет. Обрабатывали по 3 слайда от каждого донора на экспериментальную точку. Для анализа и обработки микрофотоизображений ДНК-комет использовали программу СASP 1.2.2 ('^ASPla^'). В качестве критерия поврежденности ДНК использовали Оливе момент хвоста (произведение % ДНК в хвосте на расстояние от центра ядра до центра плотности ДНК в хвосте ДНК-кометы в пикселях).
2) Модифицированный метод ДНК-гало в щелочных условиях [12]. Вкратце, клетки лизирова-ли в холодном (4°C) буфере (2.5 моль/л NaCl, 100 ммоль/л Na2EDTA, 20 ммоль/л Tris-HCl, pH 10.0, 1% Triton X-100 и 10% DMSO) в течение 1 ч. После лизиса клеток слайды переносили в холодный (4°C) щелочной раствор (300 ммоль/л NaOH, 2 ммоль/л EDTA-Na2, рН > 13) и выдерживали 20 мин после чего проводили 3-кратную промывку в трис-боратном буфере, рН 8.2. Слайды фиксировали в 70%-ном этаноле в течение 10 мин. Для окраски ДНК использовали SybrGreen I ("Invitrogen"). Визуализацию ДНК-гало проводили с помощью люминесцентного микроскопа Люмам Р-8 ("ЛОМО", Россия) с использованием системы визуализации микрофотоизображений " Микромед- 1600-3ф" ("ЛОМО"). На каждом слайде регистрировали по 100 нуклеоидов. На каждую точку обрабатывали по 3 слайда от каждого донора. В зависимости от степени диффузии ДНК нуклеоиды относили к одному из трех классов: А — отсутствие гало; Б — гало присутствует, но при этом размеры и интенсивность флуоресценции ядерной области меняются незначительно; B — максимальная выраженность гало, большая часть ДНК фрагментирова-на. Индекс ДНК-гало рассчитывали по формуле
ИДГ= (0 х nA + 1 х пБ + 2 х nB)/E,
где nA, пБ и nB — число нуклеоидов в категориях A, Б и B, а Е — сумма всех подсчитанных нуклеоидов.
Оливе момент хвоста ДНК-комет, усл. ед. 45
40 35 30 25 20 15 10 5 0
□ 0.14 моль/л
□ 0.20 моль/л
□ 0.35 моль/л
□ 0.50 моль/л
in
10
20
Доза, кДж/м2
Индекс ДНК-гало, усл. ед. 1.4
□ 0.14 моль/л 1.2 ^ □ 0.20 моль/л
□ 0.35 моль/л " □ 0.50 моль/л
0.8 0.6 0.4 0.2
0
10
20
Доза, кДж/м2
*
**
Рис. 1. Результаты исследований влияния инкубации в растворах с различной концентрацией NaCl на выход ОР и ЩС ДНК, индуцированных УФ-A излучением в лимфоцитах периферической крови человека in vitro, полученные с помощью метода ДНК-комет. *p < 0.05; **p < 0.01 — достоверность различий по отношению к эффектам в клетках, инкубированных в изотоническом растворе NaCl.
Рис. 2. Результаты исследований влияния инкубации в растворах с различной концентрацией NaCl на выход ОР и ЩС ДНК, индуцированных УФ-A излучением в лимфоцитах периферической крови человека in vitro, полученные с помощью метода ДНК-гало. *p < 0.05; **p < 0.01 — достоверность различий по отношению к эффектам в клетках, инкубированных в изотонич
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.