РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2014, том 54, № 4, с. 377-384
МОДИФИКАЦИЯ РАДИАЦИОННЫХ ЭФФЕКТОВ
УДК [57+61]::539.1.04:616.1:615:539.12.04:577.3
ВЛИЯНИЕ ИОНА УРАНИЛА В НАНОМОЛЯРНЫХ КОНЦЕНТРАЦИЯХ НА ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ЭРИТРОЦИТОВ in vitro К ДЕЙСТВИЮ ФАКТОРОВ, ПРОВОЦИРУЮЩИХ ОСТРЫЙ ОКИСЛИТЕЛЬНЫЙ СТРЕСС
© 2014 г. О. Г. Шевченко*
Институт биологии Коми НЦ УрО РАН, Сыктывкар
Исследовано влияние UO2Cl2 в наномолярных концентрациях на чувствительность эритроцитов к действию факторов, провоцирующих острый окислительный стресс. Установлено, что даже кратковременный контакт с ионами уранила приводит к изменению физико-химических свойств мембран эритроцитов, что способно не только повлиять на выживаемость клеток, но и существенным образом модифицировать их реакцию на действие повреждающих факторов, в частности, индукторов окислительного стресса. Характер модификации зависит от источников образования радикалов и обусловлен как особенностями их механизмов воздействия на клетку, так и способностью уранила катализировать химические реакции с образованием АФК. Детальные механизмы воздействия уранила в низких концентрациях на клетки требуют дальнейшего изучения.
Уран, эритроциты крови, окислительный стресс. DOI: 10.7868/S0869803114040110
Уран является естественным радиоактивным элементом, широко распространенным в биосфере, а также в составе изделий, используемых в военных и промышленных целях, что обусловливает высокие риски вызываемых им повреждений для человеческой популяции в случае его хронического поступления в организм с пищей, водой и воздухом [1—4]. В окружающей среде он чаще всего встречается в наиболее стабильной форме ура-
нил-иона (UO2+), представляющей наибольшую экологическую опасность в связи с хорошей растворимостью и биодоступностью вышеуказанного соединения [5, 6].
Работ, в которых рассматриваются клеточные и молекулярные механизмы токсичности урана, существует немного, что указывает на необходимость более детальных исследований в этом направлении [7—9]. Для изучения различных аспектов действия металлов на живые организмы часто используются системы in vitro. Так, отдельные исследования механизмов токсичности урана выполнены на культурах клеток животных [10—14] и человека [15—16]. В качестве классической природной модельной мембранной системы для исследования механизмов указанной токсичности, индуцируемой тяжелыми металлами, нередко
* Адресат для корреспонденции: Республика Коми, 167982 Сыктывкар, ул. Коммунистическая, 28, Институт биологии Коми НЦ УрО РАН; тел./факс: (8212) 43-04-78; e-mail: shevchenko@ib.komisc.ru.
выбирают эритроциты [17—24]. Поскольку зрелые эритроциты крови млекопитающих лишены ядра и не способны к делению, это позволяет исключить эффекты, вызываемые повреждением ядерного аппарата клетки и индукцией систем репарации ДНК. При этом эритроциты крайне чувствительны к окислительным повреждениям вследствие высокого содержания полиненасыщенных жирных кислот в липидах их мембран и наличия гемоглобина, являющегося потенциальным промотором окислительных процессов [25— 30]. Кроме того, отдельные экспериментальные данные свидетельствуют об усилении образования активных форм кислорода (АФК) в культурах клеток животных и человека в присутствии ура-нила [31—33]. Так, введение ионов уранила в среду культивирования клеток эпителия легких крыс приводило не только к снижению их пролиферации, но и к существенному уменьшению концентрации в них восстановленного глутатиона и увеличению содержания вторичных продуктов ПОЛ, что свидетельствует о развитии окислительного стресса [31]. Усиление образования АФК наряду с изменением ультраструктуры клеток наблюдали и в человеческих остеобластах, культивированных в присутствии уранила в течение суток [32]. Важно отметить, что активацию ПОЛ наблюдали авторы, использовавшие в работе препараты с разным изотопным составом природного урана, существенно отличавшиеся по удельной активности. В частности, усиление образования АФК,
Влияние предварительного внесения в инкубационную среду и02С12 (10 и 250 нмоль/л (в контрольные образцы вместо уранил-хлорида вносили физраствор)) на параметры окислительного гемолиза эритроцитов под влиянием ААРН (прибавленного через 1 ч инкубации клеток с И02С12 и замены среды на свежий физраствор)
Параметры
Вариант опыта % гемолиза, через 3 ч % гемолиза, через 4 ч metHb/oxyHb ferrylHb/oxyHb
Контроль 32.4 ± 2.4 82.9 ± 2.2 0.523 ± 0.033 0.236 ± 0.011
UO2Cl2 10 нмоль/л 88.9 ± 2.3* 98.8 ± 0.5* 1.281 ± 0.113* 0.448 ± 0.037*
UO2Cl2 25 0 нмоль/л 88.1 ± 4.3* 97.9 ± 2.0* 1.340 ± 0.063* 0.478 ± 0.027*
Примечание. Здесь и на рисунках * — различия между контролем и опытом статистически значимы прир < 0.05, ** — прир < 0.01.
падение содержания восстановленного глутатио-на, поражение мембран митохондрий и лизосом происходило в гепатоцитах крыс, экспонированных in vitro с обедненным ураном [33]. Индукцию окислительного стресса связывают как с химическими свойствами этого тяжелого металла, так и с его радиоактивностью как а-излучателя и, соответственно, способностью вызывать радиолиз воды [3, 7]. Таким образом, можно предполагать, что уран даже в низких концентрациях способен не только изменять антиоксидантный статус клеток, но и модифицировать их реакцию на действие иных повреждающих агентов.
Целью настоящей работы было исследование влияния иона уранила в наномолярных концентрациях на чувствительность эритроцитов к действию веществ, способных провоцировать острый окислительный стресс.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Для проведения экспериментов использовали эритроциты крови лабораторных мышей. После декапитации животных кровь собирали в гепари-низированные пробирки. Эритроциты отделяли от плазмы и других форменных элементов крови центрифугированием в течение 5 мин, после чего осадок их дважды промывали физраствором (с рН 7.4); эритроцитарную массу, полученную от нескольких животных, объединяли для каждой серии опытов. Для проведения экспериментов использовали 0.5%-ную суспензию эритроцитов в физрастворе, поскольку буферные растворы, содержащие фосфаты и HEPES, формируют стабильные комплексы с уранил-ионом [34]. В качестве источника ионов уранила использовали раствор UO2Cl2 (ч. д. а., Минхимпром СССР), в котором радиоактивный элемент представлен природной смесью изотопов. Инкубацию исследуемых образцов проводили в термостатируемом шейкере "Biosan ES-20" (Латвия) при 37°С и мед-
ленном перемешивании. Острый окислительный стресс индуцировали в клетках через час после введения в инкубационную среду ионов уранила растворами H2O2 (конечная концентрация 0.9 ммоль/л) либо 2,2-азобис-(амидинопропан)-дигидрохлорида (ААРН, "Sigma-Aldrich", Германия, конечная концентрация 5 ммоль/л). Каждый час из инкубационной среды отбирали аликвоту клеточной суспензии, центрифугировали в течение 5 мин (1600 g), % гемолиза определяли по содержанию гемоглобина в супернатанте на спектрофотометре "ThermoSpectromic Genesys 20" (США) при X 524 нм [35]. Процент гемолиза рассчитывали по отношению к полному гемолизу образца по формуле: А = Б/В х 100%, где А — процент гемолиза, Б — оптическая плотность супер-натанта исследуемого образца, В — оптическая плотность супернатанта образца той же клеточной суспензии, подвергнутого полному гемолизу [36, 37]. Содержание в инкубационной смеси вторичных продуктов ПОЛ, реагирующих с 2-тио-барбитуровой кислотой ("Merck", Германия), определяли спектрофотометрически при X 532 нм [38]. Для оценки накопления продуктов окисления гемоглобина анализировали спектр поглощения гемолизата в интервале длин волн 540— 640 нм. Содержание различных форм гемоглобина (oxyHb, metHb и ferrylHb) рассчитывали с учетом соответствующих коэффициентов экстинк-ции [29]. Каждый эксперимент проводили в 3— 5 повторностях. Статистическую обработку данных и построение диаграмм осуществляли с помощью пакета программ Microsoft Office Excel 2007 и Statistica 6.0. Экспериментальные данные в таблице и на рисунках представлены в виде среднеарифметических значений с указанием их среднеквадратичных ошибок (M± m). Статистическую значимость различий оценивали по непараметрическому критерию Манна—Уитни.
Гемолиз, % 7 6 5 4 3 2 1 0
0 5 10 50 100 250 500 750 1000 Концентрация, нмоль/л
Рис. 1. Гемолиз эритроцитов крови лабораторных мышей в присутствии и02С12 (0—1000 нмоль/л) через 4 ч инкубации.
Гемолиз, % 40 35 30 25 20 15 10 5 0
1
2 3 4
Продолжительность инкубации, ч
2
3
□ 5
РЕЗУЛЬТАТЫ
В предварительных экспериментах было выявлено (рис. 1), что присутствие ионов уранила в наномолярных концентрациях ведет к снижению уровня спонтанной гибели эритроцитов крови в течение первых часов инкубации. Полученные данные и анализ литературы позволяют предположить изменение физико-химических свойств клеточной мембраны под влиянием уранил-иона, что может повлиять на чувствительность клеток к воздействию иных повреждающих агентов.
Исследование влияния ионов уранила в нано-молярных концентрациях на чувствительность эритроцитов к воздействию острого окислительного стресса, индуцируемого различными инициаторами образования свободных радикалов, привело к довольно неожиданным результатам. Так, предварительное внесение в инкубационную среду уранил хлорида в концентрациях 10— 1000 нмоль/л существенным образом уменьшало повреждающее действие Н202, что проявлялось в снижении уровня окислительного гемолиза в течение всего периода инкубации, ингибировании ПОЛ и окисления оксигемоглобина (рис. 2, а, б, в).
Использование иного источника образования свободных радикалов — ААРН — при той же схеме эксперимента привело к обратным результатам. Предварительное внесение уранила в наномоляр-ных концентрациях вызвало увеличение чувствительности клеток к воздействию индуктора образования пероксильных радикалов, что привело к снижению выживаемости эритроцитов преимущественно на начальных этапах инкубации (рис. 3, а), резкому возрастанию накопления продуктов окисления оксигемоглобина и незначительному росту концентрации продуктов ПОЛ.
1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0
шеШЬ/охуНЬ
ferrylНb/oxyНb 4 □ 5
ТБК-А
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.