РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2013, том 53, № 3, с. 229-235
ОБЩАЯ РАДИОБИОЛОГИЯ
УДК [57+61]:539.1.047:591.436:612.438:612.127.2:616.89
ВЛИЯНИЕ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА ПОКАЗАТЕЛИ МАРКЕРОВ ОКСИДАТИВНОГО СТРЕССА В ПЕЧЕНИ И ТИМУСЕ КРЫС
© 2013 г. Н. И. Рябченко*, Б. П. Иванник, В. И. Рябченко, Е. С. Дегтярёва,
Л. А. Дзиковская, Р. В. Синькова
Медицинский радиологический научный центр Министерства здравоохранения Российской Федерации, Обнинск
Исследовано влияние ионизирующего излучения на показатели маркеров оксидативного стресса в печени и тимусе крыс, облученных /-лучами 60Со в дозе 4 Гр. На 1-е, 4-е, 7-е, 10-е, 14-е, 22-е и 30-е сут после облучения животных забивали и получали из печени и тимуса суспензии клеток. После центрифугирования в клеточном осадке и супернатанте, содержащем межклеточную жидкость, определяли содержание МДА, спонтанный и НАДН-индуцированный синтез супероксидного анион-радикала кислорода О-, содержание общего и свободного железа. Показано, что на 1-е сут после облучения в межклеточной жидкости и клетках тимуса и печени увеличиваются содержание МДА и уровни спонтанного и НАДН-индуцированного синтеза О-. К 4-м сут в печени эти показатели нормализуются и в дальнейшие сроки после облучения достоверно не отличаются от контрольного уровня величин. По сравнению с печенью в тимусе к 4-м сут после облучения количественный уровень показателей оксидативного стресса увеличивается и остается на повышенном уровне в течение 22 сут после облучения. Показано, что в клетках тимуса облученных животных содержание свободного железа к 4-м сут увеличиваеся в 3.6 раза и в течение последующих 22 сут достоверно превышает контрольный уровень значений. В клетках печени облучение не приводит к изменению содержания свободного железа. Различия в уровнях содержания свободного железа могут служить причиной различной чувствительности маркеров окислительного стресса тимуса и печени к радиационному воздействию.
Ионизирующее излучение, окислительный стресс, малоновый диальдегид, супероксидный анион радикал, свободное железо, печень, тимус.
БО1: 10.7868/80869803113030119
В аэрированных условиях в процессе нормальных окислительно-восстановительных биохимических реакций образуются активные формы кислорода (АФК), к которым обычно относят супероксидный анион-радикал кислорода О-, син-глетный кислород, гидроксильный радикал ОН* и перекись водорода Н2О2 [1, 2]. Гидроксильный радикал является сильным окислителем, индуцирует пероксидацию липидов, белков и нуклеиновых кислот, что приводит к появлению в структуре биополимеров органических гидроперекисей, перекисей и эпоксидов [3]. Многие авторы полагают, что АФК могут рассматриваться в качестве важнейшего компонента индуцируемой облучением нестабильности генома [4], а также в качестве сигнала для начала реализации программы апоптотической гибели клеток [5, 6].
Существенную роль в появлении радикала ОН* играют металлы переменной валентности, в
* Адресат для корреспонденции: 249036 Обнинск, Калужская обл., ул. Королева, 4, ФГБУ Медицинский радиологический научный центр Минздрава России; тел.: (48439) 9-73-70; факс: (495) 956-14-40; е-шаП: пгуаЪсИепко@гаш-bler.ru.
частности ионы железа и их хелатные комплексы. Так, ионы железа катализируют образование радикала ОН * в реакции супероксидного анион-радикала О- с перекисью водорода (реакция Хабе-ра—Вейса), а также появление радикала ОН* при каталитическом разложении перекиси водорода (реакция Фентона) и других перекисных соединений [1, 2]. Это позволяет рассматривать содержание перекисных соединений, супероксидного анион-радикала кислорода и ионов железа в качестве маркеров оксидатаивного стресса.
Ранее [7] нами было показано, что облучение, ионы железа и их хелатных комплексов приводят к увеличению в сыворотке крови содержания пе-рекисных окислительных эквивалентов и сывороточного железа. Это может, вследствие реакции Фентона, индуцировать появление дополнительного количества гидроксильных радикалов ОН *, приводящих к повреждению ядерных и мембранных структур облученных клеток.
В настоящей работе приведены результаты исследования влияния облучения на показатели маркеров оксидативного стресса в печени и тиму-
Таблица 1. Содержание малондиальдегида (пмоль/мг влажной ткани) в клеточных суспензиях тканей печени и тимуса крыс в различные сроки после общего облучения животных в дозе 4 Гр
Орган Без облучения Время после облучения, сут
1 4 7 10 14 22 30
Печень 74.9 ± 6.0 (п = 9) 124.2 ± 13.6* (п = 11) 80.9 ± 3.0 (п = 7) 91.6 ± 7.4 (п =6) 86.2 ± 2.4 (п = 6) 77.9 ± 4.7 (п = 2) 65.3 ± 4.0 (п = 2) 61.9 ± 0.0 (п = 2)
Тимус 49.8 ± 1.8 (п = 11) 93.2 ± 4.3* (п = 10) 97.1 ± 15.5* (п = 5) 79.9 ± 6.3* (п = 3) 71.6 ± 5.3* (п = 4) 66.6 ± 1.3* (п = 2) 63.7 ± 5.6* (п = 3) 46.0 ± 1.4 (п = 3)
Примечание. п — число животных в опыте. * Отличие от контроля достоверно (р < 0.05).
се, определенные на различных сроках после радиационного воздействия.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
В опытах использовали крыс линии "Вистар", самцов массой 150—200 г. Общее однократное облучение животных у-квантами 60Со проводили на установках "Гаммацелл-220" (Канада), при мощности дозы 0.2 Гр/мин и "Луч-1" (Россия), при мощности дозы 0.4 Гр/мин.
Спустя различные сроки после облучения животных забивали декапитацией и извлекали печень и тимус. Для получения суспензии клеток кусочки тканей тимуса и печени протирали через капроновую сеточку в среде Хэнкса, исходя из расчета 150 мг влажной ткани на 5 мл среды. Клеточную суспензию центрифугировали (15 мин при 1500 об./мин), в результате чего в осадок переходили клетки, а супернатант содержал межклеточную ждкость, концентрация которой зависела от количества клеток в получаемой клеточной суспензии.
В качестве маркеров оксидативного стресса использовали данные определения в межклеточной жидкости печени и тимуса содержания ма-лондиальдегида (МДА) [8], супероксидного анион-радикала кислорода О^ [9—12]. Путем влажного сжигания в присутствии марганцевокислого калия и хлористоводородной кислоты определяли в тканевых гомогенатах содержание общего железа [13] и неосаждаемого трихлоруксусной кислотой (ТХУ) свободного железа [14].
Экспериментальные результаты обработаны методами вариационной статистики, изложенными в статистических пакетах программ "Ехсе1 2010" и "81§ша81а1 3.0".
РЕЗУЛЬТАТЫ
Проведенные исследования, результаты которых представлены в табл. 1, показали, что через 24 ч после облучения в межклеточной жидкости
печени и тимуса животных увеличивается содержание МДА, что свидетельствует об интенсификации в этих условиях процессов перекисного окисления липидов. К 4-м сут после облучения содержание МДА в межклеточной жидкости печени приближается к наблюдаемому в необлучен-ном контроле. В тимусе к 4-м сут содержание МДА несколько увеличивается и остается на повышенном уровне в дальнейшем до 22-х сут. Нормализация содержания МДА в межклеточной жидкости тимуса наблюдается только на 30-е сут после облучения.
Для оценки влияния облучения на клетки печени необлученных и облученных крыс были получены клеточные суспензии, которые подвергали центрифугированию. После удаления супер-натанта клеточный осадок суспендировали в исходном объеме свежей среды Хэнкса и инкубировали в течение 60 мин при 37°С на водяной бане с перемешиванием. В табл. 2 приведены результаты анализа влияния инкубации на содержание МДА в клетках печени, полученных в различные сроки после облучения крыс в дозе 4 Гр. Результаты показали, что в отсутствие инкубации при 37°С не обнаружено достоверного влияния облучения на содержание МДА в этих клетках. Последующая инкубация при 37°С увеличивала в необлученных клетках содержание МДА, причем после инкубации клеток печени облученных крыс уровень содержания в них МДА достоверно превышал уровень содержания МДА в контроле. Пониженная стабильность клеток печени облученных крыс к перекисному окислению ли-пидов сохранялась в течение 22 сут после облучения.
В межклеточной жидкости печени и тимуса облученных и неблученных крыс исследовали НАДН-индуцированный синтез супероксидного
радикала О-.
Для проявления супероксидного анион-радикала использовали 0.02%-ный раствор красителя нитросинего тетразолия (НСТ), который при восстанавлении радикалом О^ образует окра-
Таблица 2. Влияние 60-минутной инкубации при 37°С на содержание малондиальдегида (пмоль/мг влажной ткани) в клетках печени крыс в различные сроки после общего облучения животных в дозе 4 Гр
Условия инкубации Без облучения Время после облучения, сут
1 4 7 10 14 22 30
Без инкубации при 37°С 36.4 ± 1.5 (п = 36) 38.5 ± 5.2 (п = 12) 32.1 ± 2.8 (п = 5) 46.2 ± 5.4* (п = 6) 42.1 ± 3.6 (п = 5) 36.0 ±2.8 (п = 8) 44.4 ± 1.6 (п = 5) 41.9 ± 1.2 (п = 3)
60 мин инкубации при 37°С 72.0 ± 3.7 (п = 36) 90.7 ± 5.7* (п = 10) 92.8 ± 4.2* (п = 6) 112.7 ± 8.3* (п = 4) 105.4 ± 6.1* (п = 5) 90.4 ± 5.7* (п = 6) 127.4 ± 10.2* (п = 4) 80.9 ± 4.9 (п = 3)
Примечание. п — число животных в опыте. * Отличие от контроля достоверно (р < 0.05).
Таблица 3. НАДН-индуцированная генерация супероксидного анион-радикала кислорода образцами межклеточной жидкости из печени и тимуса крыс в различные сроки после общего облучения животных в дозе 4 Гр
Орган Без Время после облучения, сут
облучения 1 4 7 10 14 22 30
Печень 494.0 ± 14.0 576.0 ± 36.6 604.8 ± 31.0* 592.4 ± 41.6* 542.8 ± 37.4 527.2 ± 14.0 569.0 ± 36.0* 522.0 ± 33.6
(п = 8) (п = 5) (п = 5) (п = 3) (п = 6) (п = 3) (п = 3) (п = 4)
Тимус 38.6 ± 1.88 63.2 ± 3.08* 71.4 ± 6.06* 62.4 ± 3.58* 52.2 ± 2.64* 40.0 ± 0.88* 58.0 ± 7.47* 54.4 ± 0.48*
(п = 14) (п = 8) (п = 6) (п = 5) (п = 6) (п = 4) (п = 2) (п = 6)
Примечание. В таблице приведены данные о количестве супероксидного анион-радикала О- (нмоль), генерированного межклеточными жидкостями из 1 мг сырой ткани печени и тимуса необлученных и облученных крыс. п — число животных в опыте. * Отличие от контроля достоверно (р < 0.05).
шенный формазан, обладающий максимумом поглощения при 560 нм [9, 10, 16]. Для определения генерации О—— к 1.9 мл 0.1 моль/л фосфатного буфера, рН 7
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.