РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2009, том 49, № 1, с. 113-116
НЕИОНИЗИРУЮЩИЕ ^^^^^^^^^^^^ ИЗЛУЧЕНИЯ
УДК [57+61]:539.1.04:611.38:615.83:612.121.2
ВЛИЯНИЕ ИОНОВ ВОДОРОДА НА ФОТОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ МЕМБРАН ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ МАКРОФАГОВ
© 2009 г. С. К. Пирутин1, 2*, В. Б. Туровецкий1, Ю. Б. Кудряшов1
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, Москва 2Институт экспериментальной и теоретической биофизики РАН, Пущино
Показано, что уменьшение внутри- или внеклеточного рН приводит к снижению содержания клеток с поврежденной мембраной в популяции макрофагов, подвергнутых действию УФ-излучения в дозе 9 Дж/см2 (А^^ = 306 нм). При повышении внутри- или внеклеточного рН выраженность мем-бранотропного действия УФ-излучения не наблюдается в условиях предварительного осмотического набухания клеток. Клетки, выжившие после УФ-облучения в дозах 8 и 10 Дж/см2 (А^^ = 297 нм), имеют сниженный внутриклеточный рН по сравнению с величиной этого параметра в не облученных клетках.
Ультрафиолетовое излучение, повреждение мембран, перитонеальные макрофаги, перекисное фотоокисление липидов, pH.
Повышение устойчивости плазматических мембран клеток к действию различных повреждающих агентов - одна из важнейших задач современных медико-биологических исследований. В развитии многих патологических состояний организма существенную роль играют процессы образования активных форм кислорода (АФК) и продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) [1-8]. Участие последних показано и при развитии повреждения клеточных мембран, вызванного высокими дозами УФ-излучения [9]. В этой связи понятен интерес, который вызывают работы, направленные на подбор агентов, стабилизирующих клеточную мембрану, а также изучение механизмов их защитного действия при повреждении последней различными факторами.
Благодаря своей значительной биологической активности, средневолновое ультрафиолетовое излучение (УФ-В, 280-320 нм) получило широкое распространение в медицине [10]. Биологическая активность этого излучения определяет его также как патогенный фактор окружающей среды и техногенного воздействия [11]. Таким образом, значительный интерес представляет как изучение повреждающего действия УФ-излучения на клеточном уровне, так и исследование модификации его эффекта в целях возможной защиты.
Как известно [12], одним из важных факторов, влияющих на структурно-функциональное состояние клетки, являются ионы водорода. Кроме того, в литературе имеются указания на то, что сниже-
*Адресат для корреспонденции: 119899 Москва, Воробьевы Горы, МГУ, Биологический фак-т, каф. биофизики; тел.: 939-51-50; e-mail: pirutin@yandex.ru.
ние pH может повышать устойчивость мембран к действию ряда неблагоприятных факторов [13].
Удобным модельным объектом исследования при изучении механизма действия какого-либо повреждающего фактора являются макрофаги -клетки-фагоциты, способные к быстрому функциональному ответу на воздействие, а также играющие важную роль в обеспечении иммунного гомеостаза организма и образующие при своем функционировании значительное количество АФК [14].
В настоящей работе мы исследовали влияние H+ на устойчивость к УФ-повреждению мембран перитонеальных макрофагов мышей, а также изменение их внутриклеточного pH в результате воздействия УФ-В.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Объектом исследования служили перитонеальные макрофаги беспородных белых мышей. Для их получения животных забивали с помощью цервикальной дислокации, вводили в брюшную полость 2 мл раствора Хенкса (содержавшего 10 ммоль/л HEPES, pH 7.2; Serva) и через несколько минут извлекали перитонеальную жидкость, обогащенную макрофагами. Подготовку препаратов клеток на покровных стеклах проводили, как описано ранее [15]. В работе использовали люминесцентный микроскоп Люмам ИЗ (ЛОМО, Ленинград). Возбуждение флуоресценции препаратов осуществляли с использованием галогенной лампы накаливания КГМ 9-70 и комбинации стеклянных светофильтров ФС 1-4 и СЗС 21-2. Определение целостности плазматической мем-
Количество поврежденных клеток, % 120 г
100-
80-
60-
4020 0
7.2 8.4 6.3 7.2 + Мон. 7.2 + ЭИПА
Рис. 1. Модификация повреждающего действия УФ-излучения на плазматические мембраны макрофагов при изменении их внутриклеточного и внеклеточного pH.
Данные представлены в виде отношения числа клеток с поврежденной плазматической мембраной к общему числу исследованных клеток, %. Доза УФ-излу-чения составляла 9 Дж/см2 (Xmax = 306 нм). Облучение клеток проводилось при различных средах инкубации последних: 7.2 - стандартная среда инкубации с pH = 7.2; 8.4 - pH среды инкубации 8.4; 6.3 -pH среды инкубации 6.3; 7.2 + Мон. - в стандартную среду инкубации за 20 мин до облучения введен мо-ненсин (5 мкмоль/л); 7.2 + ЭИПА - в стандартную среду инкубации за 20 мин до облучения введен ЭИ-ПА (5 мкмоль/л).
браны макрофагов осуществляли с помощью перекрестной окраски двумя флуоресцентными зондами, бромистым этидием и флуоресцеинди-ацетатом, в конечной концентрации 5 мкг/мл (Serva, Германия) [16]. Клетки с неповрежденной мембраной определялись по зеленой флуоресценции флуоресцеина. При повреждении мембраны в клетки проникает этидиум бромид и, связываясь с ядерной ДНК, приводит к красному окрашиванию клеток [17], при этом повреждение плазматической мембраны сопровождается вытеканием флуоресцеина. Клетки с флуорохромами инкубировали в течение 10 мин и после отмывки от не-связавшегося красителя проводили подсчет числа поврежденных клеток. Смену стандартной среды (pH 7.2) на модифицированную (с измененным pH) проводили за 20 мин до начала облучения. Подкисление внутриклеточного содержимого осуществляли, используя ингибитор Na+/H+^6-менника этилизопропиламилорид (ЭИПА) в концентрации 15 мкмоль/л, а подщелачивание - с помощью Ка+^+^онофора моненсина в концентрации 5 мкмоль/л. Введение обоих агентов в пробы также осуществлялось за 20 мин до начала облучения. В качестве источника излучения использовали лабораторный спектральный облучатель ЛОС-2 (СКБ БП АН СССР, Пущино). Облучение клеток проводили на специально изготовленном
стенде, используя интерференционные светофильтры с максимумами пропускания при X = 306 и 297 нм в комбинации со стеклянным светофильтром УФС-5 для дополнительного подавления красной компоненты. Интенсивность света при Хтах = 306 нм составляла 10 мВт/см2, а при Хтах = = 297 нм 4.4 мВт/см2. Для измерения интенсивности падающего на объект излучения использовали УФ-радиометр "Аргус-03" (ГНМЦ ВНИИ ОФИ).
Определение величины внутриклеточного рН (рН;п) осуществляли при помощи микрофлуори-метрического метода анализа одиночных клеток с использованием флуоресцентного зонда флуо-ресцеиндиацетата (5 мкг/мл) [18, 19]. Регистрацию интенсивности флуоресценции отдельных клеток проводили на микроскопе "Люмам И3" (ЛОМО, СССР), в узких полосах спектра излучения двух различных форм флуоресцеина при Х1 = = 520 и 570 нм, используя встроенные в насадку "ФМЭЛ-1А" (ЛОМО, СССР) интерференционные светофильтры. Для определения значения внутриклеточного рН пользовались калибровочной кривой, представляющей собой график зависимости величины параметра К (отношение интенсивности флуоресценции при Х1 к интенсивности при Х2) от значения рН внутриклеточного содержимого. Флуорохром вводили в среду инкубации клеток сразу после их облучения. Через 10 мин инкубации клетки отмывали от несвязав-шегося красителя и измеряли рНь. Результаты измерения рНь контрольных не облученных клеток сравнивались с рН^ клеток после УФ облучения и представлялись в виде разности этих значений.
Эксперименты проводили при температуре 22°С. Полученные данные представлены в виде средних арифметических значений исследованных параметров и их среднеквадратических ошибок. Результаты экспериментов обрабатывали статистически с использованием критерия Стью-дента. Различия между средними арифметическими значениями параметров считали достоверными при р < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Как видно из данных, представленных на рис. 1, повышение рН среды инкубации от 7.2 до 8.4 ед. приводит к увеличению числа поврежденных клеток в популяции макрофагов, подвергнутых действию УФ-излучения в дозе 9 Дж/см2 (Хтах = = 306 нм). Снижение же рН среды инкубации до 6.3 приводит к существенному снижению числа поврежденных излучением клеток. Аналогичная картина наблюдалась и при изменении величины рН только внутри клеток (рН^) с помощью таких агентов, как моненсин и ЭИПА, первый из которых подщелачивает, а второй подкисляет внутриклеточное содержимое [20]. В случае подщелачи-
ВЛИЯНИЕ ИОНОВ ВОДОРОДА
115
Количество поврежденных клеток, % 100 г
90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
6.0 6.2 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 7.6 7.8 8.0 8.2 8.4 8.6 8.: рН среды инкубации
Рис. 2. Влияние гипоосмотических условий инкубации перитонеальных макрофагов мышей на рН-зависи-мость повреждающего действия УФ-излучения. Гипоосмотические условия создавали заменой стандартной среды инкубации (1) на таковую, разведенную вдвое бидистиллированной водой (2). Доза УФ-излу-чения (Хтах = 306 нм) составляла 9 Дж/см2, интенсивность 10 мВт/см2.
вания внутриклеточного содержимого увеличение фоточувствительности мембран носит более выраженный характер, чем при изменении рН среды инкубации в щелочную сторону. При снижении же рН;п с помощью ЭИПА эффект защиты плазматических мембран от УФ-излучения несколько меньше, чем при изменении рН среды инкубации клеток до 6.3 ед. Сопоставление данных, представленных на рис. 1, с таковыми, полученными нами ранее для нейтрофилов [21], показало сходный характер влияния рН среды инкубации клеток на УФ-индуцированное повреждение их мембран. В то же время имелись и некоторые различия. В экспериментах с нейтрофилами эффект защиты их мембран от УФ-излучения менее выражен по сравнению с таковыми в экспериментах с макрофагами.
При анализе полученных данных следует напомнить, что рН играет существенно важную роль в регуляции функциональной активности клеток, обладая способностью в значительной степени повышать и понижать ее [12]. Изменения концентрации Н+ способны также существенно влиять на струк
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.