ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2011, том 58, № 5, с. 719-727
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ^^^^^^^^^^^^ СТАТЬИ
УДК 581.1
ВЛИЯНИЕ ИЗБЫТОЧНОГО СОДЕРЖАНИЯ МЕДИ В СРЕДЕ НА ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ И МОРФОЛОГИЮ КОРНЕЙ СОИ
© 2011 г. А. Л. Куликова, Н. А. Кузнецова, В. П. Холодова
Учреждение Российской академии наук Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва
Поступила в редакцию 02.11.2010 г.
Изучали действие повышенных концентраций меди в среде (10—150 мкМ CuSO4) на рост и жизнеспособность корней двухнедельных проростков сои (Glycine max L., сорт Доринца). Избыток меди ингибировал как накопление биомассы, так и линейный рост растений, при этом влияние меди на рост корней было значительно сильнее, чем на рост побега. При содержании в среде 10 мкМ CuSO4 прирост биомассы растения снижался на 40%, а длина корня на 70%; при 25 мкМ CuSO4 эти показатели равнялись 80 и 90% соответственно. На 50 мкМ CuSO4 прекращался рост корней, но сохранялся небольшой прирост биомассы и длины побега. Концентрация 150 мкМ CuSO4 для растений сои оказалась летальной. Наиболее ранним признаком токсического действия избыточных концентраций меди являлось увеличение содержания малонового диальдегида (МДА), свидетельствующее об усилении перекисного окисления липидов (ПОЛ) мембран. Достоверное увеличение МДА наблюдалось при инкубации растений в течение 1 ч на среде с 10 мкМ CuSO4, при этом содержание меди в корне возрастало от 36 ± 1.8 (в контроле) до 48 ± 2.4 мкг/г сухой массы. Двукратное увеличение количества нежизнеспособных клеток, проницаемых для красителя Эванс синий, отмечалось при содержании меди в корне около 200 мкг/г сухой массы, и происходило через 72 ч роста на среде с 10 мкМ CuSO4, 6 ч — при 25 мкМ, 3 ч — при 50 мкМ и 1 ч — при 150 мкМ. Токсическое действие избытка меди проявлялось сильнее на делящихся и растущих клетках кончика корня (корневой меристеме и в зоне растяжения), чем на расположенных выше участках корня. Избыток меди приводил к образованию трещин в поверхностных слоях клеток концевых участков корня и влиял на его морфологию. При росте растений на среде, содержавшей 10 мкМ CuSO4, происходило значительное уменьшение расстояния от кончика корня до места закладки боковых корней и образование шаровидных вздутий на кончиках боковых корней. При большом избытке меди в среде (50 и 150 мкМ) развитие боковых корней полностью ингибировалось.
Ключевые слова: Glycine max — медь — стресс — корень — жизнеспособность клеток
ВВЕДЕНИЕ
Многолетнее использование медьсодержащих препаратов для борьбы с болезнями и вредителями сельскохозяйственных культур, а также загрязнения окружающей среды отходами промышленных производств являются основными причинами накопления меди в почве. Известно, что медь является необходимым элементом минерального питания растений, но превышение пороговых концентраций меди в окружающей среде оказывает значительное ингибирующее действие на рост и развитие растений [1—3]. Токсическое действие высоких концентраций меди связано с потерей избирательной проницаемости внешней и внутренних мембран клетки, нарушением транспорта электронов в электрон-транспортных
Сокращения: ТБК — тиобарбитуровая кислота; ТМ — тяжелые металлы.
Адрес для корреспонденции: Куликова Алевтина Львовна. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН. Электронная почта: akulikova05@mail.ru
цепях фотосинтеза и дыхания и инактивацией ряда ферментов, участвующих в метаболизме углеводов и синтезе белка [4]. Важную роль в этом воздействии играет то, что медь, являясь металлом с переходной валентностью, вызывает образование активных форм кислорода (АФК) и инициирует окислительный стресс в клетках растений [4, 5].
Одним из самых заметных признаков токсического действия меди на растение является ингиби-рование роста и накопления биомассы, причем этот эффект характерен в большей степени для корней, чем для надземной части растений [1, 6—8].
Присутствие в питательной среде избытка меди, так же как и некоторых других тяжелых металлов (ТМ), вызывает быстрое повреждение ризо-дермы и изменение морфологии корня [6—10], но сведения по этому вопросу весьма ограничены.
Данные о концентрационных и временных характеристиках процессов, происходящих в корнях растений под действием меди, сильно различаются в работах разных авторов, при этом поро-
говые концентрации меди в питательной среде, вызывающие ингибирующее действие на растения, могут различаться в сотни раз (от 0.1 до 1000 мкМ) (см. обзор [11]). Вероятно, это зависит от вида и возраста растения, методики эксперимента, а также от состава, ионной силы и рН питательной среды. Имеются данные, что порог токсичности ТМ может увеличиваться при увеличении концентрации солей базового питательного раствора [12].
Сведений о влиянии избытка меди на жизнеспособность корней сои практически нет, хотя соя является важной сельскохозяйственной культурой, которую часто приходится выращивать на почвах, загрязненных избыточным количеством меди.
В настоящей работе представлены результаты исследования влияния высоких концентраций меди на рост растений сои, морфологию корней, проницаемость клеточных мембран и жизнеспособность клеток концевых участков корня и дана оценка максимально допустимого для выживания этих растений избытка меди в среде.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Семена сои (Glycine max L., сорт Доринца) обрабатывали слабым раствором перманганата калия в течение 4 ч на качалке и проращивали на влажной фильтровальной бумаге в темноте при температуре 22°С в течение 2 суток. Близкие по размерам проростки (по 2 растения) пересаживали в вегетационные сосуды объемом 1 л на модифицированную среду Хогланда—Снайдерс без ЭДТА, содержавшую 10 мМ Fe(NO3)2 и 0.3 мкМ CuSO4. Питательную среду меняли один раз в неделю, при этом изменение концентрации меди в среде на протяжении эксперимента было в пределах ошибки измерения.
Растения выращивали в камере фитотрона при температуре 22—25/18—20°С (день/ночь), относительной влажности 55%, освещенности 350 мкмоль/(м2 с) (натриевые лампы Reflux 250, Россия) и световом периоде 12 ч. При проведении экспериментов двухнедельные проростки переносили на свежую питательную среду (контроль), в опытных вариантах в среду добавляли сернокислую медь до конечных концентраций 10, 25, 50 и 150 мкМ. Продолжительность воздействия ТМ варьировала от 1 ч до 10 суток.
Для изучения влияния избытка меди на рост и увеличение биомассы растений, до и после инкубации на опытной или контрольной среде, каждое растение взвешивали и измеряли длину надземной части и самого длинного корня. Длину измеряли линейкой с точностью до 1 мм. Для опыта использовали по 10 растений каждого варианта.
При определении содержания меди корни предварительно отмывали на качалке по схеме:
1 мин в водопроводной воде, 5 мин в 10 мМ ЭДТА, рН 7.0, 1 мин в дистиллированной воде. Предварительно было установлено, что такая отмывка десорбирует медь из апопласта (содержание меди в корнях растений контрольного варианта и после пребывания в течение 1 мин в растворе 150 мкМ CuSO4 и последующей отмывки не различалось). Растительный материал доводили до постоянного веса при 60°С, затем тщательно измельчали в ступке, навеску (50 мг) заливали смесью концентрированных кислот (1.6 мл HNO3 и 0.8 мл HClO4) и оставляли на сутки при комнатной температуре. Затем пробы прогревали последовательно в течение 1.5 ч при 160° С и 2 ч при 180°С в термостате Dry-block TDB-A-400 ("Bio-San", Латвия) и после охлаждения вносили по 5— 6 капель концентрированной Н2О2. Обесцвеченные растворы доводили до 15 мл дистиллированной водой, и концентрацию Cu измеряли с помощью атомно-абсорбционного спектрофотометра ААФ Лабист-400 ("Лабист", Россия).
Жизнеспособность клеток корня оценивали по степени потери целостности клеточной мембраны. Корни растений разных вариантов опыта окрашивали в течение 15 мин в 0.025% растворе красителя Эванс синий, содержавшем 100 мкм CaCl2, и тщательно отмывали в нескольких порциях 100 мкм CaCl2 (пока отмывочный раствор не становился бесцветным). Часть корней использовали для наблюдений под световым микроскопом, а остальные служили для количественного определения поглощенного красителя после экстрагирования в 1% ДДС [9, 13]. Для этого корни на расстоянии 0—15 и 15—30 мм от кончика нарезали на сегменты и брали навески по 100 мг. Образцы ткани растирали в 1 мл 1% ДДС, настаивали 1 ч при комнатной температуре, центрифугировали при 13 000 g 2 раза по 5 мин и определяли оптическую плотность растворов при 600 нм на спектрофотометре Genesis-20 ("ThermoSpectronic", США).
Оценку перекисного окисления липидов (ПОЛ) мембран проводили количественным методом, основанным на определении содержания малонового диальдегида (МДА) с помощью тиобар-битуровой кислоты (ТБК) [14]. Для этого 200 мг растительного материала гомогенизировали в
1.5 мл 0.1% трихлоруксусной кислоты (ТХУ). Го-могенат центрифугировали при 10000 g в течение 15 мин при 4°С. К 0.4 мл супернатанта добавляли
1.6 мл 0.5% ТБК в 20% ТХУ. Реакционную смесь инкубировали 30 мин при 95°С, после чего быстро охлаждали на ледяной бане и центрифугировали в том же режиме. Концентрацию МДА определяли по разности оптической плотности окрашенного раствора при 532 и 600 нм на спектрофотометре Genesis-20 и рассчитывали, используя коэффициент молярной экстинкции, равный 1.56 х 105 (М см)-1.
Влияние избытка меди в среде на рост и накопление биомассы растениями сои при инкубации растений на смеси Хо-гланда—Снайдерс с различной концентрацией сернокислой меди в среде
Прирост общей массы растения Прирост длины корня Прирост длины надземной части
Вариант 0—5 дней 5—10дней 0—5 дней 5—10дней 0—5 дней 5—10дней
сырая % сырая % мм % мм % мм % мм %
масса, г масса, г
Контроль 2.98 ± 0.30 100 2.86 ± 0.21 100 42 ± 4 100 42 ± 5 100 286 ± 15 100 283 ± 12 100
(0.3 мкМ CuSO4)
10 мкМ CuSO4 1.81 ± 0.19 61 1.82 ± 0.12 63 14 ± 2 33 12 ± 2 28 112 ± 9 39 86 ± 7 30
25 мкМ CuSO4 0.72 ± 0.11 24 0.54 ± 0.09 19 5 ± 1 12 3 ± 1 7 43 ± 3 15 33 ± 3 12
50 мкМ CuSO4 0.20 ± 0.05 7 0.1
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.