МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2015, том 49, № 4, с. 571-576
= ОБЗОРЫ
УДК 576.316.33
ВЛИЯНИЕ КАЧЕСТВА ДНК НА РЕЗУЛЬТАТЫ ИЗМЕРЕНИЯ
ДЛИНЫ ТЕЛОМЕР
© 2015 г. Е. Н. Воропаева1*, В. Н. Максимов1, С. К. Малютина 1, М. Bobak 2, М. И. Воевода1
Научно-исследовательский институт терапии и профилактической медицины Сибирского отделения Российской
академии медицинских наук, Новосибирск, 630089 2University College, London, WC1E6BT, United Kingdom Поступила в редакцию 24.12.2014 г.
Принята к печати 01.02.2015 г.
На сегодняшний день данные по взаимосвязи длины теломер с продолжительностью жизни и риском развития различных возрастных заболеваний противоречивы. Эти несоответствия могут быть обусловлены причинами чисто методического характера, например различиями в способах измерения длины теломер, сбора клеток, выделения ДНК и хранения материала. Одно из общих требований к экспериментам, связанным с измерением длины теломер, — использование образцов ДНК высокого качества. В представленном обзоре рассмотрены наиболее распространенные ошибки в измерении длины теломер, связанные с ненадлежащим качеством материала, взятого в исследование.
Ключевые слова: длина теломер, качество ДНК, количественная ПЦР, ТЯГ, преаналитический этап.
EFFECTS OF THE DNA QUALITY ON THE RESULTS OF TELOMERE LENGTH MEASUREMENTS, by E. N. Voropaeva1*, V. N. Maksimov1, S. K. Malyutina1, M. Bobak2, M. I. Voevoda1 ^Institute of Internal and Preventive Medicine, Siberian Division, Russian Academy of Medical Sciences, Novosibirsk, 630089 Russia;*E-mail: vena.81@mail.ru; 2University College, London, WC1E6BT,United Kingdom). The data on the relationship of telomere length with life expectancy and the risk of development of various age-related diseases are inconsistent. These discrepancies may be resulted from differences in methods for telomere length measurement, cells collection, DNA extraction and material storage. One of the general requirements for experiments related with a measurement of telomeres is a use of DNA samples of high quality. In the review, the most common errors associated with an improper quality of telomere-containing biological materials under investigation are considered.
Keywords: telomere length, DNA quality, quantitative PCR, TRF, pre-analytical phase. DOI: 10.7868/S0026898415040199
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время широко изучается один из потенциальных механизмов старения организма — укорочение хромосом на концевых участках, получивших название "теломеры". Считается, что этот фактор может определять как продолжительность жизни человека, так и его предрасположенность к тем или иным социально-значимым заболеваниям.
В целом ряде исследований с многолетними наблюдениями за выборками людей были получены убедительные данные о том, что длина тело-мер может служить важным предиктором продолжительности жизни [1—5]. Известны и работы, в которых ассоциация длины теломер с заболеваемостью и смертностью не подтверждена — напро-
Принятые сокращения: TRF (terminal restriction fragment)
* Эл. почта: vena.81@mail.ru
тив, у большей части групп обследования наблюдалось увеличение или стабильная длина теломер во времени [6—8]. Данные литературы о взаимосвязи укорочения длины теломер с риском развития сердечно-сосудистых заболеваний и злокачественных новообразований также противоречивы [9, 10]. Причина плохой воспроизводимости результатов, по крайней мере, частично может быть связана с недостаточно освещенными методологическими вопросами преаналитического этапа исследований длины теломер [11—13].
Различия в применяемых методах измерения длины теломер, особенности выполнения методик в лабораториях, а также влияние таких факторов, как метод выделения ДНК и особенности
— метод конечного рестрикционного фрагмента.
хранения материала, могут быть потенциальными причинами, лежащими в основе плохой воспроизводимости результатов исследований [4]. Так, внутрилабораторная вариабельность между анализами для количественной флуоресцентной гибридизации in situ составляет > 5%, для количественной ПЦР > 6% и Саузерн-блота > 2% [14]. Межлабораторные различия могут быть значительно выше.
В настоящее время разработан ряд технологий для измерения длины теломер. Они отличаются один от другого по количеству материала, требуемого для исследования, а также преимуществами и техническими недостатками [15]. Методы гибри-дизационной защиты от гидролиза (hybridisation protection assay, HPA), детекции состояния тело-мер, основанной на дотировании синтетических олигонуклеотидных зондов (telomeric- oligonucleotide ligation assay, T-OLA), а также методы конечного рестрикционного фрагмента (terminal restriction fragment, TRF), количественной ПЦР и анализа длины единичной теломеры (single telomere length analysis, STELA) основаны на анализе ДНК. Одно из общих требований для всех этих методов — применение ДНК высокого качества [16—18], хотя для количественной ПЦР это требование менее жесткое, чем для TRF [3, 13, 17, 19, 20].
Метод TRF является "золотым стандартом" в изучении длины теломер. При этом в литературных источниках наиболее широко представлены работы, в которых для измерения относительной длины теломер применялась количественная ПЦР. Последнее обусловлено широким распространением и большей чувствительностью данного метода, меньшими время- и трудозатратами, а также необходимостью меньшего количества ДНК, взятого в исследование, в сравнении с TRF [21—23]. Вместе с тем, в сравнительном исследовании наблюдали высокую корреляцию результатов измерения длины теломер методами Саузерн-бло-та или TRF и методом количественной ПЦР [13].
Поскольку все методы измерения длины тело-мер чувствительны к качеству ДНК, способу выделения ДНК, времени между сбором образца и выделением нуклеиновых кислот, ошибки на этих этапах при выполнении исследования могут приводить к неверным оценкам длины теломер [24, 25].
В связи с этим еще на этапах планирования исследования необходимо учитывать ряд факторов, перечисленных в методологическом обзоре Nus-sey с соавт. [25]. В зависимости от целей работы авторам предстоит решить, какой вид ткани будет изучаться. Если планируется исследовать клетки крови, то все лейкоциты или определенный их пул. Необходимо будет определить метод забора материала (инвазивный или неинвазивный) и условия хранения собранного образца (в специа-
лизированном буфере или без него, при какой температуре, в течение какого времени). Важными являются вопросы порядка выделения и хранения ДНК: насколько быстро после забора клеток и каким методом будет выделяться ДНК, каким способом будет оценено количество и качество полученной ДНК, сколько аликвот и какой стандартной концентрации ДНК будет приготовлено, в течение какого времени и в каких условиях хранить ДНК.
В представленном обзоре рассмотрены наиболее распространенные ошибки в измерении тело-мер, связанные с ненадлежащим качеством материала, взятого в исследование.
ЗАБОР И ХРАНЕНИЕ МАТЕРИАЛА
Измерение длины теломер может быть выполнено на любой популяции клеток, из которых возможно выделить неповрежденную ДНК высокого качества [23]. При этом на качество и количество ДНК, которая может быть выделена из образца и использована для последующего измерения длины теломер, имеют прямое влияние как способ забора клеток, так и условия и продолжительность процедуры.
Теломеры высокочувствительны к окислительному повреждению [26]. При хранении клеток и тканей деградация ДНК начинается именно с концов хромосом. В связи с этим изменение ДНК может происходить еще до ее выделения из образца. Следует выбирать наиболее щадящие методы забора, которые смогут обеспечить минимальное повреждение собранных клеток. Большая доля поврежденных клеток в образце может приводить к искажению результатов измерения длины теломер, так как длина теломер некротически или апопто-тически измененных клеток короче, чем у жизнеспособных клеток [23].
Из наиболее надежных методов хранения материала используется глубокая заморозка в жидком азоте. В таких условиях материал может храниться до 10 лет. При размораживании важно повышать температуру образца очень медленно, поместив его в лед [23, 27].
Показано, что деградация ДНК полностью отсутствует при условии ее выделения из свежесобранного материала или из материала, который пусть длительно (до 10 лет), но хранился при —80°С или в жидком азоте. Исследование длины тело-мер рекомендуется выполнять сразу после выделения ДНК; если такой возможности нет, то ДНК помещают на хранение при температуре от —20° С до —80°С до момента проведения эксперимента [25, 28-32].
Однако опыт исследователей свидетельствует, что и в условиях большого разброса температур хранения материала (от +2°С до —20°С) может
ВЛИЯНИЕ КАЧЕСТВА ДНК НА РЕЗУЛЬТАТЫ ИЗМЕРЕНИЯ ДЛИНЫ ТЕЛОМЕР
573
быть получена ДНК хорошего качества и в достаточном количестве для измерения длины теломер как методом TRF, так и количественной ПЦР [1, 25, 33—35]. Это дает возможность использовать архивные материалы, а также образцы ДНК, которые не были собраны специально для измерения длины теломер [20].
Следует заметить, что применение в качестве биологического материала для измерения длины теломер срезов тканей, фиксированных формалином, нежелательно, так как ДНК в парафини-зированных блоках претерпевает значительные изменения, так что измерение длины теломер дает противоречивые результаты [17, 30, 35—37]. Исключение составляет разработанный недавно метод титрования количества ДНК теломер (telomere DNA content titration assay). Показано, что для этого анализа требуется всего около 5 нг ДНК (эквивалент < 1000 клеток), причем полученные результаты не зависят от состояния фрагментации ДНК. Это дает возможность измерять длину теломер как в свежесобранных, так и в замороженных и залитых в парафиновые блоки тканях, хранящиеся около 20 лет [29, 33, 36].
ВЫДЕЛЕНИЕ И ХРАНЕНИЕ ДНК
При исследовании теломер необходимо четко представлять условия хранения и экстракции ДНК, а также качественные и количественные характеристики проб — это позволит оценить влияние предшествующих этапов на результаты
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.