ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2008, том 55, № 3, с. 368-373
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1
ВЛИЯНИЕ КАРТОЛИНА НА ОРИЗАЛИН-ИНДУЦИРОВАННЫЕ
ИЗМЕНЕНИЯ АКТИВНОСТИ ЛЕКТИНОВ ПРИ НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОМ ЗАКАЛИВАНИИ РАСТЕНИЙ
© 2008 г. О. А. Тимофеева, Л. Д. Гараева, Ю. Ю. Чулкова, Л. П. Хохлова
Биолого-почвенный факультет Казанского государственного университета, Казань
Поступила в редакцию 19.09.2007 г.
В корнях 7-дневных проростков трех сортов озимой пшеницы (Triticum aestivum L.), различающихся по морозоустойчивости, изучали влияние картолина (33 мкМ), антистрессового регулятора роста цитокининового типа, на цитоскелет-зависимые изменения активности лектинов незакаленных (23°С) и закаленных к холоду (3°С, 7 суток) растений. Картолин сортоспецифично повышал активность растворимых и связанных с клеточной стенкой лектинов у незакаленных растений, что, по всей вероятности, важно для последующего усиления адаптационных процессов в клетке. Ингибитор полимеризации микротрубочек оризалин уменьшал активность растворимых лектинов и увеличивал активность связанных с клеточной стенкой лектинов. Снижение чувствительности активности лектинов к оризалину при обработке картолином может быть следствием его стабилизирующего влияния на цитоскелетные структуры и взаимодействия между лектинами клеточной стенки и микротрубочками. Наиболее эффективное действие картолина - уменьшение влияния оризалина на активность лектинов закаленных растений - отмечено у слабоморозоустойчивого сорта. По-видимому, обработка картолином более эффективна для активизации адаптационных процессов с участием цитоскелетных структур у менее устойчивых сортов.
Ключевые слова: Triticum aestivum - лектины - цитоскелет - картолин - низкотемпературное закаливание.
ВВЕДЕНИЕ
Проблема адаптации является одной из центральных в биологии и, прежде всего, в физиологии растений и растениеводстве. Познание субклеточных и молекулярных механизмов защитно-приспособительных процессов имеет первостепенное значение не только для разработки новых принципов отбора устойчивых форм, но и для коррекции устойчивости ценных сельскохозяйственных культур в условиях возрастающей нестабильности климата.
Особое место в исследовании этих механизмов занимает цитоскелет. Благодаря его роли в архитектуре клеток, цитоскелет контролирует пространственно-временную организацию и координацию клеточного метаболизма в норме и при стрессе и, в итоге, сохранение структурно-функциональной целостности клеток [1].
Новый этап в исследовании ответных реакций растительных клеток на воздействия окружающей среды связан с развитием представлений о
Адрес для корреспонденции: Тимофеева Ольга Арнольдовна. 420008 Казань, Кремлевская ул., 18. Казанский государственный университет, биолого-почвенный факультет, кафедра физиологии и биотехнологии растений. Факс: 007 (843) 238-71-21; электронная почта: 0^а.Т1то1ее-va@ksu.ru
том, что взаимодействия между цитоскелетом, плазмалеммой и клеточной стенкой играют ключевую роль в восприятии и проведении внешнего сигнала путем создания динамической механической связи между компонентами цитоскелета [2]. В осуществлении контактов между плазмалем-мой и клеточной стенкой могут принимать участие лектины - белки, характеризующиеся высокой специфичностью к углеводным детерминантам сложных гликоконъюгатов.
Несмотря на имеющиеся сведения о зависимости активности лектинов от структурной целостности цитоскелета [3], механизмы регуляции их активности при действии регуляторов роста остаются недостаточно исследованными.
Для решения этого вопроса мы использовали картолин, антистрессовый регулятор роста цитокининового типа [4], повышающий устойчивость растений к различным неблагоприятным факторам среды [5-7], в том числе и к морозу [5, 8].
Цель работы заключалась в выяснении участия лектинов и цитоскелета в реализации защитного действия картолина на растения озимой пшеницы в условиях низкотемпературного закаливания.
МЕТОДИКА
Объектом исследований служили корни проростков озимой пшеницы (Triticum aestivum L.) трех различающихся по морозоустойчивости сортов: Безостая 1 - слабоморозоустойчивый, Мироновская 808 - среднеморозоустойчивый, Альби-дум 114 - высокоморозоустойчивый сорт.
Растения незакаленного варианта выращивали при температуре 23°С в кюветах на водопроводной воде при освещенности 100 Вт/см2 и 12-часовом фотопериоде в течение 9 суток. К половине незакаленных 6-дневных растений в среду выращивания добавляли регулятор роста карто-лин до конечной концентрации 33 мкМ, на которой растения продолжали расти при 23°С в течение 3 суток. В опытах с картолином и закаливанием к 6-дневным проросткам, за сутки до закаливания, в среду добавляли картолин до той же концентрации, и затем 7-дневные растения переносили для закаливания в термокамеру при 3°С на 7 суток. В результате возраст незакаленных растений был 9 суток, а закаленных - 14 суток. В предварительных опытах было показано, что такие условия выращивания позволяют выравнивать высоту незакаленных и закаленных растений, чтобы избежать влияния различий в ростовых процессах.
Ингибитор полимеризации тубулиновых белков оризалин ("Dr. Ehrestorfer GmbH", Германия) вводили в ткани путем инкубации в 10 мкМ растворе в течение 3 ч незакаленных и закаленных растений, выращенных как с картолином, так и без него. Для экстрагирования растворимых лек-тинов 0.5 г корней гомогенизировали в 5 мл 0.05 N HCl, постоянно перемешивая в течение 1 ч при 4°С. Затем экстракт центрифугировали при 10000 g 20 мин при 4°С, осадок промывали 2.5 мл 0.05 N HQ и снова центрифугировали. Надоса-дочные жидкости объединяли, нейтрализовали натрий-фосфатным буфером (1 М, рН 7.4) в соотношении буфер : экстракт 1 : 2, супернатант еще раз центрифугировали и использовали для определения лектиновой активности [9]. Выделение лектинов клеточных стенок проводили по методу, описанному в работе [10]. Осадок после экстрагирования растворимых лектинов гомогенизировали в среде, содержавшей 20 мМ К-фосфат-ный буфер (рН 7.4), 10 мМ ЭДТА, 0.05 мМ дитиотрейтол ("Serva", Германия) и 0.5 мМ фе-нилметилсульфоксид ("Serva"). Гомогенат фильтровали через капроновую ткань. Осадок, содержавший клеточные стенки, после многократной промывки гомогенизирующей средой и ацетоном экстрагировали исходной средой с добавлением Тритона-Х-100 (в конечной концентрации 0.05%) ("Serva") и 0.9% NaCl, настаивали 3 ч при 4°С и постоянном перемешивании, затем центрифугировали 30 мин при 10000 g. Осадок отбрасывали, а
супернатант использовали для определения активности лектинов.
Активность лектинов определяли методом агглютинации трипсинизированных эритроцитов I группы крови человека. Для этого готовили серию двукратно разведенных белковых экстрактов на иммунологических планшетах с U-образ-ными лунками. Результат реакции регистрировали через 2 ч после титрования. Активность лектинов выражали в величинах, обратных минимальной концентрации белка (мг/мл)-1, при которой отмечали реакцию гемагглютинации. Получение эритроцитов проводили по методу Луцик с соавт. [11].
Белок определяли по методу Bradford [12].
На рисунках приведены средние арифметические значения из трех биологических повторно-стей эксперимента и их стандартные ошибки.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Антистрессовый препарат цитокининового типа действия картолин повышал активность как растворимых, так и связанных с клеточной стенкой лектинов в корнях незакаленных растений всех исследуемых сортов озимой пшеницы (рис. 1 и 2). Наибольшую чувствительность к картолину обнаруживали растворимые лектины морозоустойчивых сортов Мироновская 808 и Альбидум 114. Наименьший эффект картолин оказывал на активность лектинов клеточной стенки высокоморозоустойчивого сорта Альбидум 114.
Обработка картолином закаленных растений практически не оказывала влияния на активность лектинов клеточной стенки (рис. 2), тогда как активность растворимых лектинов в этих условиях усиливалась (рис. 1). Реакция активности растворимых лектинов корней закаленных растений на действие картолина обратно коррелировала со степенью устойчивости сорта. Наибольший эффект картолина на активность лектинов наблюдали у слабоморозоустойчивого сорта Безостая 1 (219%), наименьший - у высокоморозоустойчивого сорта Альбидум 114 (154%).
Как известно, цитоскелет является важнейшим звеном сигнального аппарата клеток, обеспечивающим восприятие и трансдукцию различных сигналов, в том числе и гормонального [13].
Под влиянием оризалина активность растворимых лектинов в незакаленных растениях всех исследованных сортов озимой пшеницы снижалась (рис. 1), в большей степени у слабоморозоустойчивого сорта Безостая 1. У этого сорта закаливание уменьшало действие оризалина. В адаптированных к холоду растениях устойчивых сортов наблюдали повышение активности растворимых лектинов при действии оризалина (рис. 1).
250 г 200 -
150 -100 -
w
§ 50 &
0
§ 250
J200
§ 150 м
н100
м
<D
* 50
л
н
§ 0
| 250 н
200
Безостая 1
150 100 50 0
Альбидум 114
lÉliÉ
Незакаленные Закаленные
Рис. 1. Оризалин-индуцированные изменения активности растворимых лектинов в корнях проростков Безостой 1 (слабоморозоустойчивый сорт), Мироновской 808 (среднеморозоустойчивый сорт) и Альбидум 114 (высокоморозоустойчивый сорт). 1 - контроль; 2 - картолин (33 мкМ); 3 - оризалин (10 мкМ); 4 - картолин (33 мкМ) + оризалин (10 мкМ).
350 300 250 200 150
к 100 ол 50
а нт 0 ко350 о 300 ^ 250 g 200 тин150 к
лек100
g 50 ост 0
| 350 ^300 А250 200 150 100 50 0
3 Безостая 1
Мироновская 808
I
Альбидум 114
Незакаленные Закаленные
Рис. 2. Оризалин-индуцированные изменения активности лектинов клеточных стенок в корнях проростков Безостой 1 (слабоморозоустойчивый сорт), Мироновской 808 (среднеморозоустойчивый сорт) и Альбидум 114 (высокоморозоустойчивый сорт). 1 - контроль; 2 - картолин (33 мкМ); 3 - оризалин (10 мкМ); 4 - картолин (33 мкМ) + оризалин (10 мкМ).
Оризалин сортосиецифично повышал активность лектинов клеточной стенки в корнях незакаленных растений всех трех сортов. При этом обнаружена обратная зависимость между уровнем устойчивости сорта и степенью действия о
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.