ОНТОГЕНЕЗ, 2004, том 35, № 1, с. 23-32
КЛЕТОЧНАЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВКА И ПРОЛИФЕРАЦИЯ
УДК 576:351
ВЛИЯНИЕ КАТЕХОЛАМИНОВ НА МИГРАЦИЮ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКУ ГОНАДОТРОПИН-РИЛИЗИНГ ГОРМОН-НЕЙРОНОВ У КРЫС
© 2004 г. М. С. Извольская******, С. Н. Воронова**, И. Г. Макаренко**, А. Дуиттоз***, И. Тийе***, А. Калас****, М. В. Угршмов***
*Институт нормальной физиологии им. П К. Анохина РАМН 103009 Москва, ул. Большая Никитская, д. 6 **Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН 119991 Москва, ГСП-1, ул. Вавилова, д. 26 ***Лаборатория контроля овуляции, Национальный институт сельскохозяйственных исследований
37380 Нузийи, Франция
****Институт нейронаук, Национальный центр научных исследований, Университет П. и М. Кюри
75252 Париж, наб. Сен-Бернара, д. 7 Поступила в редакцию 24.07.02 г.
Окончательный вариант получен 04.08.03 г.
Гонадотропин-рилизинг гормонпродуцирующие нейроны являются ключевым звеном нейроэндо-кринной регуляции репродуктивной системы во взрослом организме. Синтез и выделение гонадотропин-рилизинг гормона в свою очередь находятся под афферентным катехоламинергическим контролем. Учитывая то, что катехоламины в онтогенезе оказывают морфогенетическое влияние на клетки-мишени, целью данной работы явилось исследование такого рода действия катехоламинов на развитие гонадотропин-рилизинг гормон-нейронов в онтогенезе у крыс. Проведен сравнительный количественный и полуколичественный анализ дифференцировки и миграции гонадотропин-рилизинг гормон-нейронов у плодов (самцов и самок) крыс в условиях нормального метаболизма катехоламинов (введение физраствора) и при фармакологически вызванном их дефиците (введение а-метил-иара-тирозина). Продемонстрировано, что ингибирование синтеза катехоламинов с 11-го дня эмбрионального развития привело к увеличению количества гонадотропин-рилизинг гормон-нейронов в ростральных отделах траектории их миграции по мозгу: на 17-й день эмбрионального развития - в области обонятельных туберкул, а на 18-й и 21-й дни эмбрионального развития - в области обонятельных луковиц. Кроме того, оптическая плотность этих нейронов, расположенных в ростральных отделах миграции, была выше у плодов, получавших а-метил-иара-тирозин в процессе эмбрионального развития по сравнению с контролем. Сделан вывод о том, что катехоламины оказывают стимулирующее влияние на миграцию гонадотропин-рилизинг гормон-нейронов и влияют на их дифференцировку.
Ключевые слова: эмбриогенез, нейрогенез, передний мозг, а-метил-иара-тирозин, иммуноцитохи-мия, анализ изображения.
Гонадотропин-рилизинг гормон (ГРГ), синтезируемый нейронами септо-преоптической области переднего мозга, участвует в регуляции секреции лютеинизирующего и фолликулостимули-рующего гормонов аденогипофиза у взрослых животных, а в онтогенезе оказывает влияние на дифференцировку гонадотропоцитов (ИегШег е! а1., 1994). ГРГ-нейроны млекопитающих образуются в эмбриогенезе в назальной области головы из медиальной части обонятельного эпителия и в процессе дифференцировки мигрируют в сеп-то-преоптическую область (8еИ,№ате1-Рикиёа, Кай, 1989; е! а1., 1989; Ба1коки-Шёо е! а1., 1990; Яоппек1е1у е! а1., 1990; СаМат е! а1., 1995).
Миграция ГРГ-нейронов осуществляется вдоль терминального и вомероназального нервов и, как предполагается, у разных видов направляется различными молекулами клеточной адгезии ^гау е! а1., 1994; УоэЫёа е! а1., 1995; Таго77о е! а1., 1998; УовЫёа е! а1., 1999). Начало синтеза нейро-гормона на ранних этапах миграции ГРГ-нейронов, а также достаточно раннее формирование механизмов ответа на внеклеточные сигналы является характерной чертой этой популяции нейронов (Кшапо е! а1., 1995).
Одним из важнейших регуляторов функциональной активности ГРГ-нейронов у взрослых животных являются катехоламины (Ка1га Р., Ка1-
ra S., 1983; Kalra, 1985), в основном дофамин и норадреналин, поступающие по афферентным волокнам из перивентрикулярного ядра гипоталамуса и ствола мозга (Jennes et al., 1982, 1983; Horvath et al., 1993). Действие катехоламинов опосредовано рецепторами, которые экспрессируют-ся ГРГ-нейронами (Lee et al., 1995; Hosny, Jennes, 1998). В "донейротрансмиттерном" эмбриональном периоде развития мозга катехоламины являются высокоэффективными морфогенетическим факторами, влияющими на дифференцировку и миграцию клеток-мишеней (Lauder, 1993; Pab-bathi, 1997).
Цель работы - определение возможной роли катехоламинов в регуляции миграции и диффе-ренцировки ГРГ-нейронов. Для этого изучены распределение ГРГ-нейронов вдоль траектории миграции и их оптическая плотность (ОП) у плодов крыс с нормальным метаболизмом катехоламинов и при фармакологически вызванном их дефиците.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Условия эксперимента. В экспериментах использовали 18 беременных крыс линии Вистар. Для получения датированной беременности самцов подсаживали на ночь к самкам, при обнаружении сперматозоидов во влагалищных мазках этот день считали первым днем беременности. Животных содержали в стандартных лабораторных условиях: при 12-часовом световом дне и при температуре +20°С.
Девяти беременным самкам внутрибрюшинно вводили а-метил-пара-тирозин (аМПТ), ингибитор синтеза катехоламинов (100 мг/г веса в 0.5 мл 0.9%-ного NaCl), с 11-го дня эмбрионального развития (Э11) по: Э16 - трем, Э17 - трем и Э20 -трем. В контроле девяти беременным самкам по той же схеме вводили 0.9%-ный NaCl.
Фиксация и иммуноцитохимия. На следующий день самкам вводили пентобарбитал (100 мг/кг веса) и извлекали плоды на Э17, Э18 и Э21. Пол плодов определи: на Э17 и Э18 - по гонадам и на Э21 - по аногенитальному расстоянию. Плоды перфузировали через сердце физиологическим раствором на фосфатном буфере (ФРФБ) (0.9%-ный NaCl, 0.02 М ФБ, рН 7.4) в течение 5 мин и далее 4%-ным параформальдегидом на 0.1 М ФБ (рН 7.4) в течение 10 мин. После этого производили декапитацию, головы дофиксирова-ли в 4%-ном параформальдегиде на 0.1 М ФБ (рН 7.4) в течение ночи при температуре +4°С, затем отмывали 30 мин в ФРФБ и помещали на 36 ч в 15%-ный раствор сахарозы на 0.02 М ФРФБ для криопротекции. Головы замораживали в изопен-тане, охлажденном до - 40°С жидким азотом, и хранили при температуре - 80°С. Далее приготав-
ливали фронтальные серийные срезы толщиной 16 мкм на криостате "Reichert" (Германия) при температуре - 20°С. Для иммуноцитохимической реакции каждый второй срез самцов и самок экспериментальных и контрольных групп монтировали на одно стекло и инкубировали во влажной камере последовательно в ФРФБ с: 1) 1%-ной нормальной сывороткой козы и 0.3%-ным Тритоном X-100 ("Sigma", США) 30 мин при комнатной температуре; 2) первичными кроличьми антителами против синтетического ГРГ (1 : 15000), при +4°С с 1%-ной нормальной сывороткой козы и 0.3%-ным Тритоном X-100 15 ч; 3) вторичными козьими биотинилированными антителами против иммуноглобулинов кролика (1 : 200) ("Vector Laboratories, BIOSYS", США) 2 ч при комнатной температуре и 4) авидин-биотин-пероксидазным комплексом ("Vector Laboratories, BIOSYS", США) 1 ч при комнатной температуре. Срезы промывали в ФРФБ после каждой инкубации, за исключением первой. Специфичность первых антител проверяли ранее (Beauvillain, Tramu, 1980), а также путем исключения первых антител из процесса инкубации. На последнем этапе срезы промывали в 0.05 М трис-буфере (pH 7.6) и пе-роксидазную реакцию выявляли в том же буфере, содержащем 0.03% 3,3'-диаминобензидина те-трагидрохлорида ("Sigma", США) и 0.01% Н2О2. Затем срезы обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации, просветляли в ксилоле и заключали в пермаунт.
Анализ результатов. Серии срезов (каждая из пяти анализированных серий содержала срезы самцов и самок контрольной и опытной групп) просматривали в рострокаудальном направлении и на каждом втором срезе подсчитывали все им-мунореактивные нейроны, а также оценивали их ОП, для чего использовали метод полуколичественной иммуноцитохимии, позволяющий определить относительную концентрацию иммунореак-тивного материала, содержащегося в нейронах. Срезы просматривали в микроскопе (увел. х 300), соединенном последовательно с видеокамерой и компьютером. Полученное черно-белое изображение обрабатывали с помощью программного обеспечения CartoR ("IMSTAR", Франция). Относительную концентрацию иммунореактивного материала измеряли как "уровень серого" (УС) полученного черно-белого изображения нейрона, выделяемого при помощи инструмента "лассо". ОП определяли относительно УС по формуле (Smolen, 1990):
ОПнейрона _ lg ( УСфона/УСнейрона).
УСфона определяли в непосредственной близости от иммунореактивных нейронов на участке, не содержащем специфически окрашенных структур.
Данные по количеству нейронов и их ОП усредняли по пяти последовательным срезам (срезы объединяли в группы по пять, начиная с самого рострального) в каждой серии. В результате получали среднее количество нейронов и среднее значение их ОП на срез в каждой группе -Ир и ОПср;. Общее количество нейронов (Иср) в каждой группе срезов определяли как Ир х 10. Поправки двойного подсчета нейронов не вводили, так как основной задачей нашей работы являлось сравнение полученного количества нейронов у животных различных групп, а не точное определение общего количества иммунореактивных нейронов. Затем подсчитывали общее количество и процентное распределение ГРГ-иммунореактив-ных нейронов по траектории их миграции.
Данные пяти анализируемых серий объединяли, учитывая анатомические макроориентиры. Для этого были выделены следующие зоны вдоль пути миграции ГРГ-нейронов: 1) назальная область головы от ростральной части вомерона-зального органа до рострального окончания обонятельных луковиц; 2) область обонятельных луковиц, в которой располагались также хрящевой зачаток решетчатой пластинки решетчатой кости и каудальные отделы обонятельных полостей; 3) область переднего мозга от каудальной части обонятельных луковиц до ростральной границы септума (область обонятельных туберкул); 4) область септума до ростральной границы преопти-ческой области; 5) область переднего гипоталамуса (рис. 1).
Статистическая обработка. Для относительного количества нейронов подсчи
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.