ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 3, с. 440-448
УДК 581.1
ВЛИЯНИЕ КИНЕТИИА ИА АКТИВНОСТЬ НАЧАЛЬНЫХ ЭТАПОВ БИОСИНТЕЗА ХЛОРОФИЛЛА В ОБРАБОТАННЫХ СТРЕПТОМИЦИНОМ ПРОРОСТКАХ ЯЧМЕНЯ
© 2007 г. Е. Б. Яронская*, Е. Р. Грицкевич*, Н. Л. Трухановец**, Н. Г. Аверина*
* Институт биофизики и клеточной инженерии Национальной академии наук Белоруссии, Минск ** Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Белоруссии, Минск
Поступила в редакцию 11.07.2006 г.
Обработка семян ячменя (Hordeum vulgare L.) ингибитором синтеза пластидных белков - стрептомицином, привела к развитию проростков альбино-фенотипа c недифференцированными, лишенными рибосом пластидами, содержание хлорофилла (Хл) в которых составило 0.1% от регистрируемого в листьях контрольных растений. Основным результатом действия антибиотика явилось практически полное подавление способности растений синтезировать 5-аминолевулиновую кислоту (АЛК), предназначенную для образования Хл. Активность синтеза АЛК, предназначенной для образования геминовых порфиринов в этиолированных, зеленеющих после этиоляции и в выросших на свету растениях белого фенотипа, не зависела от действия света и кинетина. В верхней части листьев "стрептомицинового" варианта с дефицитом Хл 60% наблюдали смесь клеток с нормально развитыми хлоропластами, хлоропластами, содержащими единичные тилакоиды и граны, а также с полностью недифференцированными пластидами. В такой ткани была отмечена стимуляция ки-нетином синтеза АЛК, однако намного сниженная по сравнению с таковой в листьях контрольных растений. Количество эндогенных цитокининов в этиолированных и зеленеющих растениях "стрептомицинового" варианта практически не отличалось от содержания цитокининов в контрольных проростках. В выросших на свету растениях уровень цитокининов в белой ткани был выше в среднем в 2 раза по сравнению с их количеством в зеленых листьях контрольных растений. Отмеченная корреляция между способностью кинетина стимулировать синтез АЛК, используемой в образовании Хл, содержанием Хл и уровнем организации внутренней структуры хлоропластов в значительной степени поддерживает гипотезу о том, что для реализации фитогормонального ответа в растении необходима нормально развитая внутренняя структура пластид.
Hordeum vulgare - 5-аминолевулиновая кислота - цитокинины - стрептомицин - пластиды
ВВЕДЕНИЕ
Рост и развитие растений регулируется целым набором фитогормонов, каждый из которых специфически воздействует на метаболизм растительной клетки. Под контролем важнейших представителей класса растительных фитогормонов, цитокининов, находятся рост, деление и дифференциация клеток, биогенез хлоропластов, мобилизация питательных веществ, старение, цветение и многие другие процессы. Цитокинины активируют дифференциацию этиопластов в темноте и развитие хлоропластов на свету [1, 2], стимулируют синтез хлоропластных белков как ядерного, так и пластидного происхождения [3-6],
Сокращения: АЛК - 5-аминолевулиновая кислота, ЛК - ле-вулиновая кислота, Хл - хлорофилл.
Адрес для корреспонденции: Яронская Елена Брониславовна. 220072 Минск, ул. Академическая, 27. Институт биофизики и клеточной инженерии НАНБ. Факс: 375 (17) 284-23-59; электронная почта: yaronskaya@biobel.bas-net.by
а также образование фотосинтетических пигментов [7, 8]. Стимуляция цитокининами образования хлорофилла (Хл) [7, 8], по крайней мере, частично обусловлена активацией синтеза первого специфического предшественника всех тетрапирролов, молекул 5-аминолевулиновой кислоты (АЛК) [9] и более высоким уровнем светочувствительной протохлорофиллидоксидоредуктазы, фермента, катализирующего фотовосстановление протохло-рофиллида до хлорофиллида [10]. Повышенная способность к синтезу АЛК связана с увеличением как уровня транскриптов для катализирующей образование АЛК глутамил-тРНК-редуктазы, так и активности этого фермента [11]. Мы установили, что стимулирующее действие кинетина на систему биосинтеза Хл обусловлено не только увеличением скорости синтеза АЛК, но и адекватным повышением количества и активности ключевых ферментов магниевой ветви биосинтеза растительных порфиринов - Mg-xелатазы и S-аденозил-L-метионин : Мg-протопорфирин IX-метилтрансферазы [12]. Таким образом, очевид-
но, что функционирующая в хлоропласте система биосинтеза Хл чрезвычайно чувствительна к ци-токининовому воздействию.
Недавно было показано, что функциональная активность хлоропластов, развитие и состояние их внутренней структуры важны для нормального ответа растительной клетки на цитокинины [13]. Авторы выдвинули гипотезу, что действие цитокининов реализуется только при наличии в растительной клетке дифференцированных хлоропластов. В этой связи представлялось важным изучить роль структурно-функционального состояния хлоропластов в восприятии растительной клеткой цитокининового сигнала и/или его тран-сдукции к цитокинин-чувствительным ядерным генам, кодирующим ферменты системы биосинтеза Хл.
Удобной модельной системой для исследования координации между структурно-метаболическим состоянием пластид и уровнем экспрессии ядерных генов, кодирующих хлоропластные белки, являются обработанные антибиотиком -стрептомицином - растения альбино-фенотипа, содержащие недифференцированные рибосом-дефицитные пластиды [14, 15]. В данной работе дана характеристика пигментного состава листьев ячменя белого фенотипа, индуцированного стрептомицином, а также проведен анализ активности отдельных звеньев системы биосинтеза Хл. Кроме этого, было изучено влияние кинетина на активность ключевой стадии в биосинтезе Хл -образования молекул АЛК - в разных частях обработанных стрептомицином проростков с разным уровнем дефицита Хл, а также в контрольных этиолированных, зеленеющих и полностью зеленых растениях.
МЕТОДИКА
Выращивание растений. В экспериментах использовали 7-дневные проростки ячменя (Hor-deum vulgare L., сорт Гонар). Перед посадкой семена опытного варианта обрабатывали стрептомицином, помещая их в раствор антибиотика (5 г/л) на 14 ч. Растения выращивали под белыми люминесцентными лампами (80 мкмоль/(м2 с)) в режиме 14 ч света/10 ч темноты, либо в условиях полной этиоляции с их последующим освещением в течение 5 ч.
Обработка растений кинетином и отбор проб.
Начиная с 4-дневного возраста, этиолированные или выращиваемые на свету проростки ячменя опрыскивали 3 раза в день в течение трех суток раствором кинетина (93 мкМ) (опыт), либо водой (контроль). В некоторых экспериментах использовали также кинетин в концентрации 9.3 и 232 мкМ. Пробы опытного варианта составляли из фенотипически белых нижних частей листьев
длиной 2-3 см. В некоторых опытах использовали также верхние части листьев без явных признаков альбинизма (хлорина-фенотип). Контролем служили аналогичные части листьев растений, обработанных водой. Растения, которые освещали в течение 5 ч, для удобства называли "зеленеющими", хотя нижняя часть листьев "стрептомицинового" варианта оставалась белой независимо от условий выращивания.
Определение содержания Хл и каротиноидов.
Количество Хл и каротиноидов определяли методом ВЭЖХ [16] с использованием хроматографа фирмы "Agilent" (Германия).
Определение накопления АЛК. Срезанные листья инкубировали 5 ч на свету, либо в темноте на 0.05 М растворе левулиновой кислоты (ЛК) в 0.1 М Трис-НС1-буфере (pH 6.5). Экстракцию и анализ количества АЛК проводили, как описано в работе [16]. Образцы, содержавшие АЛК, конденсировали с ацетилацетоном в течение 15 мин при 100°С, после чего к ним добавляли модифицированный реактив Эрлиха, и количество АЛК определяли спектрофотометрически при длине волны 553 нм, используя молярный коэффициент экстинкции 6.8 х 104 М-1 см-1 [18].
Определение активности АЛК-дегидратазы.
Активность АЛК-дегидратазы определяли в го-могенатах листьев по методу [19] и рассчитывали в нмолях порфобилиногена, образовавшегося из экзогенной АЛК в течение 1 ч, на 1 мг белка.
Анализ количества цитокининов. Экстракцию цитокининов проводили, согласно методу, описанному в работе [20]. Экстракт цитокининов подкисляли до рН 2.5 и очищали на колонке с Dowex50W х 8 (Н+-форма, 200-400 меш.). Элюцию цитокининов с колонки проводили 4 N NH4OH. Элюат упаривали практически досуха на роторном испарителе, осадок растворяли в 80%-ном этаноле и добавляли равный объем воды. Полученные образцы упаривали так, чтобы конечная концентрация спирта не превышала 5%, после чего к ним добавляли равный объем 10 мМ фосфатного буфера, рН 7.2, содержащего 150 мМ NaCl. В полученных препаратах определяли суммарное количество производных зеатина методом твердофазного иммуноферментного анализа [21] с помощью иммуноферментных наборов, полученных из Института биологии Уфимского НЦ РАН. В качестве стандарта использовали зеатинрибо-зид ("Sigma", США). Определение цитокининов проводили в 4-кратной биологической и 3-кратной аналитической повторностях.
Электронная микроскопия. Для электронно-микроскопических исследований отрезки листьев зеленого, альбино- и хлорина-фенотипов, выращенных в режиме свет/темнота, фиксировали в 6.5%-ном глутаровом альдегиде с последующей дофиксацией в 2%-ной осмиевой кислоте, обезво-
Таблица 1. Содержание Хл и каротиноидов в листьях проростков альбино-фенотипа (опыт, "стрептомицино-вый" вариант) и зеленых растений ячменя (контроль)
Содержание пигментов, мкг/г сырой массы
Вариант неоксан- виолак- антерак- лютеин зеаксан- Хл b Хл a Р-каро- X Хл X кароти-
тин сантин сантин тин тин ноидов
Контроль 13.8 13.8 0 32.7 0 121.5 380 29.2 501.5 89.5
Опыт 0 0 0.47 1.14 1.67 0 0.47 0.30 0.47 3.58
Примечание. Растения контрольного и опытного вариантов выращивали при 14-часовом фотопериоде. Для анализа использовали нижние части листьев. Приведены средние значения из трех экспериментов. Стандартные отклонения не превышали 5% от величины средних значений.
живали по общепринятой методике и заливали в аралдит. Ультратонкие срезы готовили на ультрамикротоме LKB (Швеция) и контрастировали цитратом свинца по Рейнольдсу. Срезы исследовали на электронном микроскопе JEM 100CX (Япония).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Содержание Хл и каротиноидов
О
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.