научная статья по теме ВЛИЯНИЕ КИНЕТИНА НА СОСТОЯНИЕ ПРОТОХЛОРОФИЛЛОВОГО ПИГМЕНТА В СИСТЕМЕ ВНУТРЕННИХ МЕМБРАН ЭТИОПЛАСТОВ Биология

Текст научной статьи на тему «ВЛИЯНИЕ КИНЕТИНА НА СОСТОЯНИЕ ПРОТОХЛОРОФИЛЛОВОГО ПИГМЕНТА В СИСТЕМЕ ВНУТРЕННИХ МЕМБРАН ЭТИОПЛАСТОВ»

БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2008, том 25, № 4, с. 285-291

УДК 577.581.174.1

ВЛИЯНИЕ КИНЕТИИА НА СОСТОЯНИЕ ПРОТОХЛОРОФИЛЛОВОГО ПИГМЕНТА В СИСТЕМЕ ВНУТРЕННИХ МЕМБРАН ЭТИОПЛАСТОВ

© 2008 г. Г. Е. Савченко, Л. Ф. Кабашникова

Институт биофизики и клеточной инженерии Национальной академии наук Беларуси, 220072 Минск,

ул. Академическая, 27; факс: (375-17)284-2359; электронная почта:@ photobio@biobel.bas-net.by

Поступила в редакцию 13.02.2008 г.

После доработки 16.04.2008 г.

Изучали влияние кинетина на состояние мембран этиопластов в этиолированных проростках ячменя (Hordeum vulgare L.), контролируемое по изменению соотношения интенсивности флуоресценции двух форм протохлорофиллида (Пд) в низкотемпературных спектрах флуоресценции листьев, - длинноволновой (пигмент-белковые агрегаты) с максимумом свечения при 657 нм (Пд657) и коротковолновой (мономерной) с максимумом при 633 нм (Пд633). Действие кинетина (20 мкг/мл, опрыскивание) приводило к снижению величины отношения интенсивностией Пд657/Пд633, а тепловой шок (ТШ, 3 ч при 40°С) на фоне кинетина усиливал наблюдаемый эффект. Характер влияния кинетина на состояние форм Пд не зависел от возраста проростков (5, 6 или 7-дневные), но в более старых растениях эффект усиливался: отношение интенсивности флуоресценции двух спектральных форм Пд после ТШ снижалось в 5- и 7-дневных проростках соответственно в 1.4 и 1.3 раза, под влиянием кинетина - в 2.2 и 2.9, а при совместном действии кинетина и ТШ - в 3.0 и 4.4 раза по сравнению с контрольными вариантами. Обсуждаются возможные механизмы влияния кинетина на мембранную систему этиопластов.

Регуляция биогенеза хлоропластов - одно из наиболее ярких проявлений биологической активности цитокининов. Известно, что эти фитогормо-ны контролируют развитие хлоропластов, биогенез фотосинтетических мембран, синтез хлорофилла и его устойчивость при старении растительных тканей [1-5]. Действие экзогенного аналога растительных цитокининов - кинетина приводит к активации синтеза 5-аминолевулиновой кислоты (АЛК) [5, 6] и увеличению содержания одного из главных белков внутриэтиопластных мембран протохлорофилли-доксидоредуктазы (ПОР) в семядолях зеленеющих этиолированных проростков огурца и люпина [7, 8]. В листьях зеленеющих этиолированных проростков ячменя кинетин вызывает рост активности и содержания ряда ферментов системы биосинтеза протохлорофиллида (Пд), функционирующих до и после стадии образования АЛК [9] при незначительной стимуляции гормоном общего количества [9], а также доли неактивного Пд в этиопластах до освещения [10]. Литературные данные в целом указывают на то, что экзогенный кинетин в отсутствие света подготавливает ферментную систему биосинтеза предшественников хлорофилла к ускоренному синтезу пигментов при освещении, о чем свидетельствует и возрастание скорости ресинтеза Пд в темноте после кратковременного освещения, и скорости накопления хлорофилла при продолжительном освещении этиолированных семядолей и проростков злаков [3-5, 9, 10]. В настоящей ра-

боте на примере этиолированных проростков ячменя исследован результат этой подготовки на мембранном уровне, значение которого, на наш взгляд, недооценивается при исследовании проблемы организации и функционирования системы биосинтеза хлорофилла на стадии этиоляции.

В качестве индикатора состояния системы внутренних мембран этиопластов в этиолированных растениях использовано количественное соотношение интенсивностей флуоресценции основных форм протохлорофиллового пигмента in vivo, которое можно изучать с помощью низкотемпературных спектров флуоресценции нативных листьев. Известно, что одна из форм пигмента, флуоресцирующая при 655-657 нм, представляет собой агрегаты ПОР-Пд и находится в мембранах полукристаллических проламеллярных тел (ПЛТ), а другая, с максимумом свечения при 633 нм, связана в основном с плоскими мембранами протилако-идов (ПТ), в которых агрегаты Пд-ПОР отсутствуют [11-14]. Изменение соотношения форм Пд под влиянием различных факторов, включая тепловой стресс [15-17], послужило основой для развития представлений о динамичном состоянии внутренних мембран этиопластов как единой кооперативной системы [11, 16, 17]. Целью настоящей работы являлось дальнейшее развитие этих взглядов на примере экспериментов с кинетином, увеличивающим уровень белков в клетке и пластидах.

635 655

X, нм

635 655

X, нм

Рис. 1. Типичные спектры флуоресценции листьев 5-дневных этиолированных проростков ячменя, выращенных на водопроводной воде при 23°С (1); обработанных раствором кинетина (20 мкг/мл, 5-кратное опрыскивание в течение суток после достижения 4-дневного возраста) (2); проростков, подогретых в темноте в течение 3 ч при 40°С после выращивания на воде (3) и после обработки кинетином (4).

Пд657/Пд633 6

Рис. 2. Изменение отношения интенсивностей флуоресценции длинноволновой (657 нм) и коротковолновой (633 нм) форм Пд в листьях 6-дневных этиолированных проростков ячменя, выращенных на водопроводной воде при 23°С (1); обработанных раствором кинетина (20 мкг/мл, опрыскивание в течение 2 сут после достижения 4-дневного возраста) (2); подогретых в течение 3 ч при 40°С после выращивания на воде (3) и после обработки кинетином (4).

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Объектом исследований служили этиолированные проростки ячменя сорта Гонар, выращенные на водопроводной воде на сетках при 23-26°С в полной темноте в течение 5-7 сут. В опытном варианте листья интактных проростков опрыскивали из пульверизатора 5 раз в сутки раствором кинетина (20 мкг/мл). Тепловой стресс создавали нагреванием нативных проростков контрольного либо кинетинового вариантов в течение 3 ч при 40°С. Низкотемпературные (-196°С) спектры флуоресценции листьев регистрировали не ранее чем через 2 ч после завершения ТШ на установке [18]. Лист ячменя прикрепляли липкой прозрачной лентой к специальному металлическому держателю так, чтобы регистрируемый участок располагался на расстоянии 1.5 см от верхушки. Эту процедуру выполняли на слабом зеленом свету, безопасном для фотовосстановления Пд. Образцы с наклеенными

листьями погружали в сосуд с жидким азотом и выдерживали в нем до измерения. Флуоресценцию Пд возбуждали светом с длиной волны 440 нм. Величину отношения интенсивностей флуоресценции Пд657/Пд633 рассчитывали по интенсивно-стям свечения пигментов в максимумах обоих пиков без учета перекрывания полос свечения двух форм. На рисунках приведены типичные кривые (рис. 1) и спектры флуоресценции, демонстрирующие диапазон биологического разброса в одном из экспериментов (рис. 3), средние результаты величины отношения интенсивностей флуоресценции Пд657/Пд633 в одном эксперименте (рис. 2) и усредненные результаты нескольких экспериментов (табл. 1).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

На рис. 1 представлена близкая к среднестатистической спектральная картина действия кинети-

1

0

Влияние экзогенного кинетина (20 мкг/мл) и теплового стресса (40°С, 3 ч) на параметры флуоресценции этиолированных листьев ячменя разного возраста*

Вариант Возраст проростков, сут

5 6 7

Контроль 4.78 ± 0.70 5.23 ± 0.80 7.06 ± 1.18

Кинетин 2.19 ± 0.01 (2.18) 2.34 ± 0.36 (2.23) 2.44 ± 0.35 (2.89)

ТШ 3.40 ± 0.06 (1.41) 3.13 ± 0.20 (1.67) 5.56 ± 0.76 (1.27)

Кинетин + ТШ 1.59 ± 0.17 (3.00) 1.57 ± 0.26 (3.33) 1.59 ± 0.40 (4.44)

* Приведены средние величины отношения интенсивностей флуоресценции Пд657/Пд633 (± стандартная ошибка); в скобках показана степень снижения величины отношения по сравнению с соответствующим контролем.

на на листья 5-дневных проростков ячменя, обрабатывавшихся гормоном, начиная с 4-дневного возраста. Под влиянием кинетина особенно заметно увеличивалось свечение коротковолновой формы Пд, в результате чего величина отношения ин-тенсивностей флуоресценции длинноволновой и коротковолновой форм Пд (Пд657/Пд633) снижалась более чем в 2 раза по сравнению с контролем (с 4.78 ± 0.70 в контроле до 2.19 ± 0.01 в кинетино-вом варианте, таблица). Действие ТШ на растения контрольного варианта приводило к меньшему по сравнению с кинетином снижению этой величины (с 4.78 ± 0.70 в контроле до 3.40 ± 0.06 после ТШ, снижение в 1.4 раза), но на фоне обработки кинетином эффект теплового стресса заметно усиливался, и величина отношения снижалась в 3 раза (1.59 ± 0.17). Более продолжительная обработка

4-дневных проростков кинетином (в течение 2 сут) вызывала аналогичный эффект (рис. 2).

На рис. 3а приведены спектры флуоресценции листьев 7-дневных этиолированных проростков, обработанных кинетином с 5 по 7-е сут включительно. Разные варианты спектров приведены для демонстрации диапазона разброса данных. Известно, что экзогенные цитокинины не транспортируются по растению, а действуют в месте обработки [19]. Вполне вероятно, что этим можно объяснить наблюдавшуюся нами спектральную картину, которая, скорее всего, отражает не столько онтогенетические различия (в работе использовали идентичные по размеру и степени выхода из колеопти-ля листья), сколько неравномерность локальной концентрации гормона в исследуемых участках листа. В этом эксперименте нагревание проростков, обработанных кинетином, также существенно увеличивало относительное содержание коротковолновой формы Пд (рис. 36). При этом ее свечение в ряде случаев было доминирующим. Такой выразительный эффект однако приводил к увеличению среднеквадратичного отклонения (см. таблицу). При прекращении обработки кинетином его влияние на соотношение форм Пд сохранялось по крайней мере в течение суток (данные не приведены).

Из данных таблицы видны онтогенетические различия в относительном содержании коротковолновой формы Пд в контрольном варианте, указывающие на продолжающееся формирование системы внутренних мембран этиопластов между

5-ми и 7-ми сут (рост величины отношения интен-сивностей свечения Пд657/Пд633). Обычно при условиях выращивания, аналогичных использованным нами, накопление Пд в тканях листа ячменя завершается к 7-8 сут с момента замачивания семян [20]. Большой разброс данных в контрольных вариантах можно объяснить низкими значениями свечения коротковолновой формы Пд на фоне высокой и в меньше

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком