ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2015, том 464, № 5, с. 633-635
КЛЕТОЧНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 612.01.8:612.017.1:611.018.53
ВЛИЯНИЕ КИССПЕПТИНА НА ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ СЕПАРИРОВАННЫХ NK-КЛЕТОК
© 2015 г. С. В. Ширшев, И. В. Некрасова, О. Л. Горбунова, Е. Г. Орлова, И. Л. Масленникова
Представлено академиком РАН В.А. Черешневым 26.03.2015 г. Поступило 22.04.2015 г.
Исследовали влияние кисспептина в концентрациях, характерных для беременности, на функциональную активность сепарированных, цитокинпримированных МК-клеток. Установлено, что гормон повышает процент СВ56Ьг1§Ь1-МК-клеток и одновременно усиливает экспрессию на их поверхности Ь-селектина. При оценке уровня цитокинов обнаружено, что кисспептин снижает продукцию 1Ь-4, 1Ь-10 и №N-7, но стимулирует продукцию TGF-P сепарированными МК-клетками. В целом исследуемый гормон способствует формированию фенотипа и цитокинового спектра, характерного для регуляторной МК3-субпопуляции МК-клеток во время беременности.
DOI: 10.7868/S0869565215290307
Гормоны оказывают существенное влияние на функционирование клеток иммунной системы. Особенно это актуально для гормонов, продуцируемых плацентой [1]. Недавно открытый гормон кисспептин, который регулирует функционирование гонадостата на гипоталамическом уровне [2], во время беременности продуцируется плацентой и благодаря этому появляется в системном кровотоке матери [3]. Установлено, что клетки иммунной системы экспрессируют специфические мембранные рецепторы кисспептина [4].
Беременность с позиции иммунологии можно назвать феноменом успешной естественной полу-аллогенной трансплантации. При беременности супрессия адаптивного иммунного ответа матери компенсируется активацией системы естественного иммунитета. Основными эффекторами данной системы являются МК-клетки, которые в период ранней беременности составляют до 80% всех лейкоцитов децидуальной оболочки [5]. Помимо реализации своих цитотоксических функций МК-клетки имеют решающее значение для нормального развития беременности. Они поддерживают целостность децидуальной оболочки и модификацию спиральных артерий матери благодаря секреции интерферона (Ш№)-у [6]. Для реализации своей фетотрофической функции МК-клетки требуют специфических регуляторных
Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской Академии наук, Пермь E-mail: olia15 77@mail.ru
сигналов, к которым в первую очередь можно отнести гормоны фетоплацентарного комплекса.
Цель работы — исследование влияния кисспептина на функциональные характеристики сепарированных NK-клеток.
В работе использовали фракционированную суспензию мононуклеарных клеток периферической крови (МПК) 10 здоровых небеременных женщин репродуктивного возраста (от 23 до 37 лет). Суспензию МПК получали центрифугированием в градиенте плотности фиколл-веро-графина (d = 1.077 г/см3). Далее методом негативной селекции с использованием набора Dyna-beads Untouched Human NK Cells ("Invitrogen", США) получали обогащенную суспензию NK-клеток. Чистота выделения, оцениваемая по экспрессии маркера NK-клеток NKp46 (Anti-human CD335-PC5), составила 90-95%. Выделенные клетки (5 • 106/мл) инкубировали с гормоном в полной питательной среде в объеме 500 мкл (RPMI-1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 1 мМ HEPES, 2 мМ L-глута-мина, 200 ед./мл гентамицина) в течение 72 ч при 37°C в условиях 5% СО2. Кисспептин (Кисспеп-тин-54, Metastin, Synthetic, "CALBIOCHEM", США) использовали в физиологических концентрациях, соответствующих его уровню в периферической крови во II и III триместрах беременности, 4.6 и 9.6 пМ/л соответственно [3]. В контрольные пробы вместо гормона добавляли официнальный растворитель. Для поддержания жизнеспособности и роста сепарированных NK-клеток во все культуры добавляли стимулирующие цитокины ("GIBCO", США): интерлейкин 2
634 ШИРШЕВ и др.
Таблица 1. Влияние кисспептина на экспрессию функциональных молекул сепарированными NK-клетками (М ± m)
Группа n Контроль Кисспептин (4.6 пМ/л) Кисспептин (9.6 пМ/л)
NKp46+, CD56bright 10 33.22 ± 1.441 37.12 ± 1.262* 33.51 ± 0.652
NKp46+, CD56dlm 10 68.07 ± 2.688 60.30 ± 7.365 67.84 ± 6.703
NKp46+, NKG2A+ 10 21.67 ± 1.312 27.73 ± 4.399 28.47 ± 4.938
CD56brlght, CD62L+ 10 8.31 ± 1.778 12.09 ± 1.673* 13.59 ± 2.911*
CD56dlm, CD62L+ 10 27.01 ± 4.631 26.32 ± 4.726 32.40 ± 6.430
Здесь и в табл. 2: * — р < 0.05 по сравнению с контролем, п — число исследуемых образцов.
(IL-2) - 1, IL-12 - 2, IL-15 - 10 нг/мл [7]. По окончании инкубации отбирали супернатанты и оценивали их фенотип в лимфоцитарном гейте методом проточной цитометрии. Окрашивание клеток осуществляли согласно методике производителя моноклональных антител ("Beckman Coulter", США). При учете результатов подсчитывали не менее 100000 клеток. Для контроля неспецифического связывания и выделения негативного по флюоресценции лимфоцитарного окна использовали соответствующие изотипические контроли.
На выделенных NK-клетках оценивали экспрессию ингибиторной молекулы NKG2A (Antihuman CD159-PE), L-селектина (Anti-human CD62L-FITC), а также маркёра CD56 (Anti-human CD56-PE).
В супернатантах клеточных культур методом иммуноферментного анализа оценивали концентрацию IL-4, IL-10, IL-17, IFN-y и трансформирующего фактора роста (TGF)-P ("Цитокин", Россия).
Статистическую обработку результатов проводили с использованием парного критерия t Стью-дента.
Исследовано влияние на функциональную активность сепарированных цитокинпримированных NK-клеток кисспептина в концентрациях, характерных для беременности. Установлено, что гормон повышает процент NK-клеток CD56bnght и одновременно усиливает экспрессию на их поверхности L-селектина. При оценке уровня цитокинов установлено, что кисспептин снижает продукцию IL-4, IL-10 и IFN-y, но стимулирует продукцию TGF-р-сепарированными NK-клетками. В целом исследуемый гормон способствует формированию фенотипа и цитокинового спектра, характерного для регуляторной субпопуляции NK3 NK-клеток во время беременности.
Известно, что низкая экспрессия молекулы CD56 (CD56dim) служит маркёром высокой цито-токсичности NK-клеток, уровень которых снижается во время беременности. Напротив, уровень NK-клеток с высокой степенью экспрессии CD56 (CD56bright) повышается, и именно эти клетки инфильтрируют децидуальную оболочку [8].
Данный тип МК-клеток обладает низкой цито-токсичностью и выполняет регуляторные функции [9, 10].
Оценка влияния кисспептина на количество МК-клеток с разным уровнем экспрессии молекул СЭ56 (СВ56Ьг№УСВ56й1т) показала, что кисспептин в концентрации, соответствующей II триместру беременности, достоверно повышает долю клеток СЭ56Ьг18Ь1 при сравнении с контролем. Гормон также увеличивает процент МК-кле-ток СВ56Ьп§м, несущих молекулу Ь-селектина, не влияя на экспрессию ингибиторной молекулы МКЭ2А (табл. 1). Известно, что субпопуляция МК-клеток с повышенной экспрессией СЭ56, Ь-селектина и NKG2A в настоящее время рассматривается как обладающая регуляторными функциями [9, 10]. Таким образом, во время беременности кисспептин может быть одним из факторов, модулирующих функциональную активность МК-клеток, усиливая их регуляторный и снижая цито-токсический потенциал. Кроме того, достоверное увеличение клеток СВ56ЬгёМ, СЭ62Ь+ под влиянием гормона говорит о его способности усиливать миграцию данных МК-клеток в плаценту при физиологически протекающей беременности [11].
В отличие от клеток СЭ56й1т, СВ56Ьг1§м МК-клетки способны продуцировать значительные количества разных цитокинов [12], что послужило основанием выделения различных подтипов периферических и децидуальных МК-клеток. Так, МК1 продуцируют преимущественно 1К^у и фактор некроза опухоли (ТМБ)-а; МК2 — 1Ь-4, 1Ь-5, 1Ь-6, 1Ь-13; МК3 - (TGF)-p; МКг1 - 1Ь-10 [10, 13, 14]. Установлено, что в периферической крови небеременных женщин преобладают клетки МК1, продуцирующие 1К^у и в меньшей степени (TNF)-а [13]. Оценка цитокиновой продукции сепарированными МК-клетками периферической крови небеременных женщин выявила существенное преобладание IFN-y, что согласуется с литературными данными.
Как видно из табл. 2, присутствие кисспептина в культуре сепарированных МК-клеток вне зависимости от используемой концентрации не влияет на продукцию 1Ь-17, но достоверно угнетает
ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК том 464 № 5
2015
ВЛИЯНИЕ КИССПЕПТИНА 635
Таблица 2. Влияние кисспептина на секрецию разных типов цитокинов сепарированными NK-клетками, пг/мл (М ± m)
Экспериментальное воздействие n Контроль Кисспептин (4.6 пМ/л) Кисспептин (9.6 пМ/л)
IL-4 10 8.69 ± 0.188 7.46 ± 0.449* 7.72 ± 0.370*
IL-10 10 25.62 ± 1.247 22.97 ± 1.056* 22.24 ± 1.049*
TGF-ß 10 263.08 ± 7.843 247.26 ± 10.622 278.89 ± 14.257*
IL-17 10 239.36 ± 4.736 243.82 ± 14.965 241.96 ± 14.501
IFN-y 10 506.45 ± 26.403 345.82 ± 34.631* 366.27 ± 42.325*
секрецию IL-4, IL-10 и IFN-y. Одновременно гормон в высокой концентрации статистически значимо усиливает секрецию главного иммуносу-прессорного цитокина — TGF-ß.
Таким образом, кисспептин является физиологическим индуктором дифференцировки NK1-клеток в NK3. Учитывая, что TGF-ß является одним из факторов, способствующих трансформации периферических NK-клеток в децидуальные [15], роль кисспептина как фактора дифференци-ровки существенно возрастает.
В заключение необходимо отметить, что кисспептин, концентрации которого существенно повышаются благодаря плацентарному синтезу, необходим для модуляции функциональной активности NK-клеток. Гормон увеличивает долю регуляторных лимфоцитов CD56bright подтипа NK3 за счет активации продукции TGF-ß и снижения фетотоксичного IFN-y. При этом он может служить индуктором направленной миграции данных клеток в плаценту в поздние сроки беременности.
Работа поддержана грантом РФФИ № 13—04— 96035 "Механизмы гормонально обусловленной трансформации NK-клеток в период беременности".
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ширшев С.В. // Успехи соврем. биологии. 2005. Т. 125. № 6. С. 555—566.
2. Dhillo W.S., Murphy K.G., Bloom S.R. // Rev. Endocrinol. Metab. Disord. 2007. V. 8. P. 41—46.
3. Horikoshi Y, Matsumoto H., Takatsu Y, Ohtaki T.,
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.