ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2004, том 51, № 4, с. 549-554
УДК 581.1:581.331.2
ВЛИЯНИЕ КОИКАНАВАЛИНА А ИА ВЕЛИЧИНУ МЕМБРАННОГО ПОТЕНЦИАЛА И ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЙ рН В ПРОЦЕССЕ АКТИВАЦИИ ПЫЛЬЦЕВОГО ЗЕРНА ТАБАКА In Vitro
© 2004 г. Н. П. Матвеева, Д. С. Андрешк, Е. А. Лазарева, И. П. Ермаков
Кафедра физиологии растений биологического факультета Московского государственного университета
им. М.В. Ломоносова, Москва Поступила в редакцию 29.05.2003 г.
Изучали влияние кратковременного (5-10 мин) воздействия конканавалина А (Кон А) на активацию (по его действию на мембранный потенциал и внутриклеточный рН) и прорастание пыльцевого зерна Nicotiana tabacum L. in vitro. Кон А (10-1000 мкг/мл) вызывал гиперполяризацию плазматической мембраны вегетативной клетки и стимулировал прорастание пыльцевых зерен. Эти эффекты зависели от концентрации Кон А и были взаимосвязаны: величина мембранного потенциала негативно коррелировала с числом пыльцевых зерен, проросших после 1 ч инкубации (r = -0.96). Наряду с этим Кон А (100 мкг/мл) увеличивал внутриклеточный рН на 0.3 ед. Все выявленные эффекты обусловлены специфическим взаимодействием Кон А с углеводными детерминантами, поскольку конкурентный сахар метил-а-Б-маннопиранозид (0.1 М) полностью блокирует действие Кон А. Полученные данные свидетельствуют о наличии в пыльцевом зерне, предположительно на поверхности плазматической мембраны, рецепторов, специфическое взаимодействие которых с лектинами функционально значимо для процессов активации и прорастания.
Nicotiana tabacum - активация пыльцевого зерна - внутриклеточный рН - мембранный потенциал
В последние годы существенно изменились представления о роли лектинов - белков, специфически и обратимо взаимодействующих с углеводами, - в жизнедеятельности животных и растительных клеток [1-3]. Стало очевидно, что лектины участвуют в контроле внутри- и межклеточных транспортных процессов, регулируют процессы адгезии (межклеточные и клетки к матриксу), узнавания и миграции клеток, осуществляют позитивный и негативный контроль ростовых процессов и тем самым контролируют дифференциацию тканей и органов.
Вопрос о роли лектинов в регуляции прорастания пыльцевого зерна до настоящего времени не решен, хотя неоднократно обсуждался в литературе [4-9]. Эндогенные лектины в пыльце и рыльце выявлены [5, 8, 9], но не изучены. Данные о влиянии экзогенных лектинов на прорастание
Сокращения: Кон А - конканавалин А, ММП - метил-а-Б-маннопиранозид, БСЕСБ АМ - ацетоксиметиловый эфир 2',7'-бис-(2-карбоксиэтил)-5-(и-6)-карбоксифлуоресцеина, П1БАС4(3)-бис-(1,3-дибутилбарбитуровой кислоты)триме-тиноксонола.
Адрес для корреспонденции: Матвеева Наталия Павловна. 119899 Москва, Воробьевы горы, Московский государственный университет, биологический факультет, кафедра физиологии растений. Факс: 07 (095) 939-43-09; электронная почта: plantphys@biophys.msu.ru
немногочисленны и противоречивы. Так, показано, что лектины конканавалин А (Кон А) и фито-гемагглютинин (ФГА) стимулируют прорастание пыльцы лилии, сокращая продолжительность лаг-периода, предшествующего появлению пыльцевых трубок [4]. Однако на том же объекте и в том же диапазоне концентраций Кон А наблюдали ингибирование прорастания с одновременным подавлением синтеза фосфолипидов и пектинов [6, 7]. Наблюдаемые расхождения в результатах исследований влияния Кон А на прорастание пыльцы лилии можно попытаться объяснить большой продолжительностью воздействия лектина на пыльцевые зерна (около 4 ч). Известно, что за это время Кон А способен проникать внутрь клетки и влиять на биохимические процессы, протекающие в ней [10]. Что еще более существенно, на наш взгляд, в указанных экспериментах вне сферы наблюдений оставался начальный этап прорастания пыльцевого зерна (его активация) и, соответственно, влияние на эти процессы лектинов.
В задачу настоящей работы входило выявить влияние Кон А как на активацию пыльцевого зерна, так и на собственно прорастание (формирование пыльцевых трубок). Активация начинается с регидратации пыльцевого зерна [11] и включает определенную последовательность процессов: активацию ионных каналов [12, 13] и протонной
[Б1ВАС4(3)], мкм
Рис. 1. Зависимость интенсивности флуоресценции пыльцевых зерен, окрашенных Б1ВАС4(3), от концентрации красителя.
помпы [14, 15], гиперполяризацию плазматической мембраны вегетативной клетки [16, 17], интенсификацию дыхания [11] и возрастание внутриклеточного рН [18], активацию внутриклеточных ферментных систем и транспортных процессов [19], пространственную реорганизацию внутриклеточных структур [20, 21]. Для выявления действия Кон А на активацию пыльцевого зерна мы использовали два из выше указанных показателей - величину мембранного потенциала и внутриклеточный рН вегетативной клетки.
МЕТОДИКА
Растительный материал и культивирование пыльцевых зерен. Растения табака Nicotiana tabacum L. сорта Petit Havana SR1 выращивали из семян в климатической камере (25°C, 16-часовой световой день) в почве, ежедневно поливая их раствором минеральных солей [22]. Пыльцу собирали из полностью раскрывшихся цветков и помещали во влажную камеру (26°С, 2 ч), после чего культивировали в жидкой питательной среде, которая включала 0.3 M сахарозу, 1.6 мМ H3BO3, 3 мМ Ca(NO3)2, 0.8 мМ MgSO4 и 1 мМ KNO3 в 25 мМ Mes-Трис-буфере, pH 5.9 [23] с добавлением Кон A ("Sigma", США) или без него (см. ниже). В часть проб добавляли Кон А, предварительно проинкубированный в течение 30 мин с 0.1 М ме-тил-а-Б-маннопиранозидом (ММП) [4]. Контрольные эксперименты показали, что эффект добавления ММП одинаков в среде с 0.2 М и 0.3 М сахарозой, что позволило исключить осмотическую компоненту в его действии при использовании
стандартной среды прорастания, содержащей 0.3 М сахарозу. Контрольные пробы пыльцы готовили из тех же бутонов, что и пробы, подвергнутые действию Кон А, однако без добавления последнего в среду инкубации.
Оценка прорастания пыльцевых зерен. Кон А (1-1000 мкг/мл) присутствовал в инкубационной среде на протяжении первых 10 мин культивирования, после чего пыльцевые зерна от него отмывали, осаждая центрифугированием (400 g, 45 с), ресуспендировали в свежей порции инкубационной среды и продолжали инкубацию. По прошествии 50 мин от начала инкубации пробы фиксировали 2%-ным параформальдегидом в 50 мМ фосфатном буфере, рН 7.4 (6°С, 2 ч).
Процент проросших пыльцевых зерен от общего их числа определяли, просчитывая в каждой пробе по 1000 пыльцевых зерен. Данные получены не менее, чем в 6 независимых экспериментах.
Величину мембранного потенциала вегетативной клетки пыльцевого зерна измеряли, используя общепринятый метод, основанный на применении анионного флуоресцентного красителя •мс-(1,3-дибутилбарбитуровой кислоты)тримети-ноксонола (DiBAC4(3)) ("Molecular Probe", Нидерланды) [24, 25]. В качестве полностью деполяризованных использовали пыльцевые зерна фиксированные 2%-ным параформальдегидом [24, 25].
Пыльцевые зерна инкубировали вместе с красителем и Кон А (1-1000 мкг/мл) в течение 10 мин, осаждали центрифугированием и фотографировали. В контроле Кон А в среде отсутствовал.
Данный краситель ранее не использовали для анализа пыльцевых зерен, поэтому была проведена предварительная методическая работа. Определено оптимальное время окрашивания (10 мин). Рабочая концентрация красителя (5 мкМ) выбрана на линейном участке зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации красителя (рис. 1). Поскольку интенсивность флуоресценции клеток, окрашенных DiBAC4(3), зависит не только от величины мембранного потенциала, но и от внутриклеточного рН [26], была проведена дополнительная методическая работа, показавшая, что условиях полной деполяризации (посредством фиксации) плазматической мембраны вегетативной клетки изменения внутриклеточного рН в диапазоне значений рН 6.8--7.4 не сказываются на измеряемой величине мембранного потенциала (различия не превышали 4%).
Была показана также необходимость внесения поправок на изменения размеров пыльцевого зерна. Анализ полностью деполяризованных пыльцевых зерен показал, что измеренная в точке интенсивность флуоресценции пыльцевого зерна постепенно снижается с увеличением его размеров (рис. 2), достигая 0.8 от максимальной (p < 0.01).
Поэтому одновременно с измерением интенсивности флуоресценции на снимках измеряли площадь каждого пыльцевого зерна. Эти данные использовали при определении мембранного потенциала.
Абсолютную величину мембранного потенциала (Vm) в мВ определяли по формуле Vm = = (RT/F)ln(I/I0), где R - универсальная газовая константа, T - абсолютная температура, F - константа Фарадея, Ц - интенсивность флуоресценции пыльцевого зерна в исследуемой пробе, I0 -интенсивность флуоресценции пыльцевого зерна той же площади, но полностью деполяризованного (посредством фиксации).
Окрашенные пыльцевые зерна фотографировали с помощью цифровой фотокамеры Camedia C3030 Z ("Olympus", Япония), установленной на флуоресцентном микроскопе Leitz-Orthoplan ("Leitz", Германия), объектив 10х. Для возбуждения и регистрации флуоресценции использовали стандартный блок фильтров I3. Препараты фотографировали при стандартной выдержке 1/1.3. При измерении интенсивности флуоресценции и площади пыльцевых зерен использовали пакет программ AnalySIS ("SIS", Германия). Для каждого пыльцевого зерна определяли усредненную интенсивность флуоресценции в точке при n > 200 пикселей. В каждой пробе (пыльца из одного бутона) измеряли не менее 50 пыльцевых зерен, данные усредняли по результатам 9 независимых экспериментов.
Величину внутриклеточного рН определяли по методу, подробно описанному нами ранее [18]. Пыльцевые зерна окрашивали в течение 15 мин в растворе ацетоксиметилового эфира 2',7'-•мс-(2-карбоксиэтил)-5 (и -6)-карбоксифлуоресцеи-на (BCECF AM) ("Sigma") в инкубационной среде (25 мкг/мл, 25°С), отмывали от избытка красителя (400 g, 30 с) и переносили в среду, содержащую 100 мкг/мл Кон А (в контроле - в свежую порцию инкубационной среды). После 5 мин инкубации пыльцевые зерна осаждали и использовали для микрофлуориметрического измерения величины внутриклеточного рН вегетативн
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.