ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2004, том 51, № 1, с. 35-48
УДК 581.132:581.174.1:577.352
ВЛИЯНИЕ КОРНЕВОЙ ГИПОКСИИ И ДЕФИЦИТА ЖЕЛЕЗА НА ФОТОСИНТЕЗ, БИОХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ И СТРУКТУРУ ХЛОРОПЛАСТОВ ЛИСТЬЕВ ГОРОХА
© 2004 г. В. Г. Ладыгин
Институт фундаментальных проблем биологии Российской академии наук, Пущино Московской обл.
Поступила в редакцию 26.11.2002 г.
Исследовали совместное действие корневой гипоксии и дефицита железа на биохимический состав, фотосинтетические показатели и структуру хлоропластов листьев гороха (Pisum sativum L.). Оба фактора снижали накопление хлорофилла и фотосинтетическую активность, обусловливая хлороз листьев. При дефиците железа сильнее редуцировались ССК фотосистем, а при корневой гипоксии -комплексы реакционных центров ФС I и ФС II. При одновременном действии двух факторов нарушение свойств хлоропластов происходило сильнее, чем при воздействии одного из них. Однако даже у желтых и почти белых листьев сохранялись в небольшом количестве все пигмент-белковые комплексы фотосистем, слабая фотосинтетическая активность и ультраструктура хлоропластов в виде пузырьков и небольших тилакоидов, способных к формированию контактов и мелких гран. Делается вывод, что механизмы деструктивных процессов при корневой гипоксии и дефиците железа различны и влияют на хлоропласты листьев автономно.
Pisum sativum - дефицит железа - гипоксия корней - пигменты - фотосинтез - хлорофилл-белковые комплексы - реакционные центры фотосистем - структура хлоропластов
В настоящее время известно, что анаэробиоз -недостаток (гипоксия) или отсутствие (аноксия) кислорода в зоне корневой системы, а также дефицит железа отрицательно влияют на растения [1-4]. В природе часто возникают ситуации, когда одновременно с гипоксией в почве имеет место нарушение баланса питательных веществ, как по макро-, так и по микроэлементам, в том числе по дефициту железа [5, 6]. Несмотря на то, что корневая гипоксия и дефицит железа - широко распространенные факторы среды, отрицательно влияющие на рост, развитие и продуктивность растений [3, 4, 7, 8], исследований по совместному действию корневой гипоксии и дефицита железа на фотосинтетический аппарат листьев растений до сих пор практически не проводилось.
До последнего времени остается неясным соотношение отрицательных эффектов при одновременном действии этих факторов и природа их взаимодействия на уровне фотосинтетического аппарата листьев. В связи с этим, в продолжение наших предыдущих исследований по действию каждого из факторов в отдельности [7, 8], было изучено совместное действие корневой гипоксии
Адрес для корреспонденции: Ладыгин Владимир Георгиевич. 142290 Пущино Московской обл. Институт фундаментальных проблем биологии РАН. Электронная почта: ladygin@issp.serpukhov.su
и дефицита железа. Выяснение деструктивных последствий в этом случае представляется важным из-за неопределенности ожидаемых эффектов, так как в предыдущих работах не было выявлено специфического действия корневой гипоксии на уровне хлоропластов [9-11], а дефицит железа, напротив, специфически действует на структуру и функцию хлоропластов в силу преимущественной локализации ионов железа (до 60-80%) в фотосинтетических мембранах [4-6].
Цель работы состояла в том, чтобы изучить влияние гипоксии и дефицита железа на уровне корней на биохимический состав, структуру и функционирование хлоропластов листьев гороха и выяснить последствия деструктивных процессов при одновременном действии двух факторов.
МЕТОДИКА
Объект и условия культивирования. В качестве объектов использовали листья гороха (Pisum sativum L.), сорт Превосходный, выращенного в климатической камере ШКВ-I (Россия) в водной культуре на полной среде Арнона (контроль) и на той же среде [7, 8], но без добавления солей железа (дефицит железа). Семена гороха замачивали 2 сут во влажной марле для получения проростков. Затем брали по шесть пятилитровых сосудов из винипласта, высаживали по 20 шт. проростков и культивировали их в течение 20 сут. Все сосуды
35
3*
продували воздухом в автоматическом режиме по 15 мин каждые 2 ч. Растения росли при 14-часовом фотопериоде на свету 80 Вт/м2 при температуре 25°С днем и 20°С ночью. После 20 сут роста брали по три сосуда контрольных и железодефи-цитных растений продували среду аргоном 10-12 ч, а затем заливали поверхность среды вазелиновым маслом слоем 2-3 мм (корневая гипоксия). Через 3 сут в области корневой системы содержание O2 снижалось практически до нуля (аноксия корней) [11]. Аналогичным образом создавали корневую гипоксию для трех сосудов железоде-фицитных растений (дефицит железа плюс корневая гипоксия). В условиях аэрации или корневой гипоксии растения всех четырех вариантов продолжали расти еще в течение 8-10 сут. В опытах использовали листья 5-7 ярусов, взятые с 2830-дневных растений непосредственно перед началом эксперимента.
Пигменты. Качественный состав пигментов анализировали по спектрам поглощения суспензии хлоропластов in vivo при комнатной температуре (23 °C) записанным на спектрофотометре СФ-14 (Россия). Для выделения хлоропластов брали по 60 мг сырой массы листьев, растирали в ступке и центрифугированием (5000 g, 5 мин) в 3 мл 0.05 М Трис-HCl буфера, pH 7.9 получали суспензии хлоропластов. Все спектры записаны в 1 см кювете при 23°C.
Количественное содержание пигментов определяли после растирания листьев с CaCO3 в 100%-ном ацетоне и последующей экстракции и регистрации спектров с помощью спектрофотометра Specord M-40 ("Karl Zeiss", Германия) или Hita-chi-557 (Япония) по известным формулам [12].
Хлорофилл-белковые комплексы. Пигмент-белковые комплексы хлоропластов исследовали модифицированным способом гель-электрофореза [13, 14] с использованием соответствующих буферных растворов [15, 16]. Гель-электрофорез проводили при 4°C. Листья с растений брали непосредственно перед опытом, растирали в ступке, гомогенат фильтровали через капроновую ткань и центрифугированием (5000 g, 5 мин, 4°C) выделяли хлоропласты. Хлоропласты разрушали ультразвуком на приборе УЗДН-1 (Россия) в течение 30-40 с (0.2 А, 15 кГц) на холоду при температуре 0°C в Трис-НС1 буфере, pH 7.9. Методика получения мембран хлоропластов, обработка их детергентом - додецилсульфатом натрия, а также условия электрофореза были описаны ранее [7]. После электрофореза гели, содержащие хлорофилл-белковые комплексы, денситометрировали на спектрофотометре Sperord М-40 ("Karl Zeiss") при длинах волн 650 или 670 нм. Содержание комплексов рассчитывали весовым методом, сравнивая массы бумажных матриц пиков отдельных полос, вырезанных с денситограмм.
Фотосинтез и темновое дыхание. Скорость фотосинтеза и темнового дыхания листьев определяли по интенсивности O2-газообмена амперо-метрическим методом на полярографе с помощью электрода Кларка. Все образцы содержали 60 мг сырой массы листьев. Измерения проводили в 3.5 мл термостатируемой стеклянной ячейке в 0.1 М карбонатно-бикарбонатном буфере Вар-бурга № 9, pH 9.1. Интенсивность света была насыщающей и составляла 200 Вт/м2.
Фотохимическая активность ФС I и ФС II.
Число реакционных центров ФС I и ФС II рассчитывали по величине сигналов ЭПР I и ЭПР II по формулам, описанным ранее [17, 18]. Отношением числа молекул хлорофилла в образце к числу реакционных центров ФС I или ФС II характеризовали величину светособирающей антенны [18]. Эта расчетная величина числа молекул флоро-филла, приходящихся на 1 пару реакционных центров ФС I и ФС II для каждого из образцов, когда соотношение ФС I к ФС II близко к единице.
Структура хлоропластов. Ультраструктурную организацию хлоропластов анализировали на срезах кусочков листьев. Кусочки вырезали между жилками и фиксировали 1.25%-ным глутаро-вым альдегидом на фосфатном буфере pH 7.4 в течение 1.5-2 ч, затем 2 ч дофиксировали 1%-ным OsO4 при комнатной температуре. Методика обезвоживания, заливки в эпоксидную смолу, получения тонких срезов и окраски образцов описаны ранее [7]. Срезы просматривали с помощью электронного микроскопа JEM-7A ("JEOL", Япония).
В таблицах представлены средние арифметические величины и их стандартные ошибки из 3-5 независимых опытов, каждый из которых проведен в 3-кратной биологической повторности. Образцы листьев брали с растений, росших в трех сосудах, в каждом из которых было по 20 растений для всех четырех вариантов.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Содержание пигментов. Сравнительные исследования контрольных и опытных вариантов показали, что вплоть до образования листьев 4-го яруса контрольные и железодефицитные растения практически не отличались по скорости роста и содержанию пигментов. В дальнейшем при формировании листьев 5-7 ярусов рост опытных растений замедлялся, но число ярусов во всех вариантах было практически одинаковым. Однако у опытных растений при дефиците железа и при совместном действии двух факторов наблюдался прогрессирующий хлороз верхушечных листьев. Листья 5-го яруса фенотипически еще были зелеными, в то время как листья 6-го яруса стали светло-зелеными, 7-го - желтыми, а 8-го - практиче-
ски белыми. Вероятно, на первых этапах роста растений листья медленно реагировали на отсутствие железа благодаря существованию тканевых и внутриклеточных механизмов регуляции и наличию больших пулов неметаболизирующих форм железа, локализованных в хлоропластах, главным образом в виде фитоферритина [19]. Однако, когда эти пулы истощались, наблюдалось очень быстрое развитие деструктивных процессов, приводящих к хлорозу [5, 7].
Одной из основных причин хлороза и разрушения мембранной системы хлоропластов листьев, по-видимому, являлось нарушение биосинтеза хлорофилла [20-23] и мембранных железосодержащих белков [6]. Несмотря на значительное падение содержания хлорофилла в листьях 5-7-го ярусов опытных растений (рис. 1), качественный состав пигментов в них существенно не менялся. Об этом свидетельствует тот факт, что спектры поглощения пигментов хлоропластов из хлороз-ных листьев сохранили все максимумы, характерные для спектров поглощения пигментов хлоропластов из контрольных листьев.
Исследования количественного содержания пигментов показали, что
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.