НЕЙРОХИМИЯ, 2013, том 30, № 4, с. 329-334
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 612.82.:586.682.135.398
ВЛИЯНИЕ L-ДОФА НА ЦИТОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО ОБМЕНА В МОЗГЕ КРЫС, РАЗЛИЧАЮЩИХСЯ ДВИГАТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТЬЮ
© 2013 г. А. В. Сергутина*, В. И. Рахманова
ФГБУ "Научный центр неврологии" РАМН
В мозге крыс Вистар с высокой и низкой двигательной активностью в "открытом поле" количественными цитохимическими методами исследовали активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в нейронах слоев III и V сенсомоторной коры, хвостатого ядра, прилежащего ядра, гиппокампа (поле СА 3) при длительном введении Ь-ДОФА и после его отмены. Ее изменения сравнивали с изменениями активности глутаматдегидрогеназы в тех же условиях. Было выявлено, что у крыс с высокой двигательной активностью после введения Ь-ДОФА уровень глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и глутаматдегидрогеназы увеличивается в стриатуме, а их изменения в сенсомоторной коре разно-направлены. После отмены Ь-ДОФА показатели активности ферментов в мозге этих крыс соответствуют норме. У крыс с низкой локомоцией после введения Ь-ДОФА глюкозо-6-фосфатдегидроге-наза активируется в стриатуме (прилежащее ядро), глутаматдегидрогеназа в стриатуме тормозится, но активируется в гиппокампе. После отмены Ь-ДОФА в мозге этих крыс выявлено торможение глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в сенсомоторной коре (слой V) и активация глутаматдегидрогеназы в хвостатом ядре. Таким образом, показано, что ответная реакция окислительного обмена мозга на гиперфункцию дофаминергической системы зависит от индивидуальных особенностей животных, проявляющихся в их внешнем поведении, в частности в двигательной активности.
Ключевые слова: глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, глутаматдегидрогеназа, цитохимия нейронов мозга, двигательная активность крыс в "открытом поле", введение Ь-ДОФА, отмена Ь-ДОФА.
DOI: 10.7868/S1027813313030126
В настоящее время окислительный стресс рассматривают как один из средовых факторов риска заболеваний мозга, вызванных дисфункцией дофаминергической системы. В связи с этим при дисфункции дофаминергической системы имеет важное значение состояние окислительных ферментов, катализирующих реакции образования продуктов, задействованных в радикалообразовании и антиоксидантной защите, в частности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и глутаматдегидрогеназы.
Ранее проведенные цитохимические исследования выявили активность ферментов окислительного обмена глутаматдегидрогеназы и глюко-зо-6-фосфатдегидрогеназы среди наиболее информативных показателей при центральных нарушениях у крыс [1]. В последующем было установлено, что активность глутаматдегидрогеназы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в некоторых структурах мозга, участвующих в формировании и реализации целенаправленного поведения, у крыс
* Адресат для корреспонденции: 105064 Москва, пер. Обуха, 5, тел./факс: (495) 917-80-07; e-mail: sergutina.anven@yandex.ru.
Вистар с высокой и низкой двигательной активностью в норме вариабельна [2, 3].
Цель представляемой работы — цитохимическое исследование активности глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы в нейронах головного мозга крыс Вистар с особенностями двигательной активности при длительном введении Ь-ДОФА и после его отмены. Исследовали структуры мозга, ответственные за формирование и реализацию целенаправленного поведения. Также исследовали активность глутаматдегидрогеназы в нейронах тех же структур мозга крыс после отмены Ь-ДОФА. Данные по активности глутаматдегидрогеназы при длительном введении Ь-ДОФА были опубликованы ранее [3].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовались половозрелые крысы — самцы Вистар массой 200—220 г, которых тестировали в "открытом поле" в тихой слабоосвещен-ной комнате [3]. Двигательную активность крыс (количество пересечений квадратов) фиксировали визуально в течение 5 мин. Использовали крыс с высокой локомоцией — 159.4 ± 1.2 пересечений
и низкой локомоцией — 67.3 ± 1.2 пересечений квадратов. Животных со средними показателями двигательной активности в эксперимент не брали.
В 1-й группе животных изучали влияние L-ДОФА по показателю активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы. Опытным крысам с высокой (n = 6) и низкой (n = 6) двигательной активностью в течение 2 нед внутрибрюшинно вводили мад опар-125 (Roche, Швейцария), который включает L-ДОФА и ингибитор его периферического расщепления бенсеразид, в суточной дозе 25.5 мг/кг массы тела, создавая физиологическое действие, соответствующее дозе 50 мг/кг массы тела чистого L-ДОФА. Контрольным животным с высокой (n = 6) и низкой (n = 6) двигательной активностью вводили физиологический раствор в течение 2 нед.
Во 2-й группе животных изучали цитохимические показатели активности глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы и глутаматдегидрогеназы через 2 нед после отмены введения L-ДОФА. Использовали опытных крыс с высокой (n = 6) и низкой (n = 6) двигательной активностью. У контрольных крыс с высокой (n = 6) и низкой (n = 6) двигательной активностью аналогично отменяли введение физиологического раствора и через 2 нед изучали те же цитохимические показатели.
Декапитацию крыс проводили под легким эфирным наркозом. Мозг замораживали при температуре —8°С в микротоме Cryo-Cat (США) в течение 10—15 мин и затем изготавливали срезы (толщина 20 мкм) сенсомоторной коры (слои III и V), хвостатого и прилежащего ядер и гиппокам-па (поле СА3).
Срезы мозга опытных и соответствующих им контрольных животных помещали на одно предметное стекло. Так как исследовали корково-под-корковые отношения, то использовали только одну половину мозга, что позволяло помещать на предметное стекло срезы мозга нескольких животных. У всех животных брали правую половину мозга. В этих срезах тетразолиевым методом [4], используя субстрат глюкозо-6-фосфат натрия ("Serva"), нитросиний тетразолий и NADP+ ("Sigma"), выявляли активность глюкозо-6-фос-фатдегидрогеназы в цитоплазме и отростках нервных клеток в виде гранул диформазана синего цвета. Активность глутаматдегидрогеназы выявляли тем же тетразолиевым методом [4], используя NAD+ и субстрат глутамат натрия (все "Sigma").
Количественную оценку активности глутамат-дегидрогеназы и глюкозо-6-фосфатдегидрогена-зы осуществляли дискретным методом, измеряя уровень оптической плотности продукта гистохимической реакции на микроскопе ЛЮМАМ-И 3 (ЛОМО, Россия) при помощи зонда диаметром 2.5 мкм, используя фильтры с длиной волны
589 нм. В каждом из измеряемых нейронов соответствующей структуры мозга контрольных и опытных животных было получено значение экс-тинкции Еп, которую рассматривают как показатель активности фермента, выраженной в условных единицах. Экстинкция Е вычислялась по формуле E = ln Ф0/Фь где Ф0 — световой поток, прошедший вблизи среза мозга — покровное и предметное стекло, заключающая среда, и Ф1 — световой поток, прошедший через каждый исследуемый участок среза (в вольтах). В каждом из видов препаратов (фермент, структура мозга), имея не менее 5 стекол от мозга одного животного, измеряли по 25 значений Ф0 и Ф1 и рассчитывали E среднее на каждую крысу (п = 6).
Таким образом, измерения проводили на выборках по 25 нейронов в каждом из исследованных образований мозга от 6 крыс в контроле и опыте. Распределение исследованных показателей в каждой выборке подчинялось нормальному закону. Полученные данные статистически обрабатывали, используя однофакторный дисперсионный анализ (One-way ANOVA) с группирующим фактором контроль — опыт и применением пакета программ Statistica.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В таблице представлены средние значения активности ферментов (M ± SEM) в нейронах мозга контрольных животных. Соответственно на графиках средние значения активности ферментов в нейронах мозга опытных животных выражены в виде процентов от уровня у контрольных животных (100%).
Как было показано, после введения L-ДОФА в нейронах слоя III сенсомоторной коры мозга крыс с высокой двигательной активностью изменения уровня глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы не проявляются, а в нейронах слоя V сенсомотор-ной коры уровень активности фермента значимо снижается (—8%). В нейронах хвостатого ядра и прилежащего ядра активность глюкозо-6-фос-фатдегидрогеназы под влиянием L-ДОФА возрастает (на 17 и 32% соответственно). В гиппокампе этих крыс активность глюкозо-6-фосфатдегидроге-назы также увеличивается по сравнению с контрольным уровнем (+8%) (рис. 1). У крыс с низкой двигательной активностью в нейронах слоев III и V сенсомоторной коры, хвостатого ядра и гиппо-кампа влияние L-ДОФА не проявляется. В нейронах прилежащего ядра активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы значимо увеличивается (+8.5%) (рис. 1).
После отмены L-ДОФА уровень активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы во всех исследованных структурах мозга крыс с высокой двигательной активностью соответствует контрольно-
Уровень активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6ФДГ) и глутаматдегидрогеназы (ГДГ) в нейронах структур мозга контрольных крыс Вистар с высокой и низкой двигательной активностью
Ферменты Уровень активности Г-6ФДГ в контроле M ± SEM Уровень активности ГДГ в контроле M ± SEM
к действию L-ДОФА к отмене L-ДОФА К отмене L-ДОФА
Структуры мозга высокая двигательная активность низкая двигательная активность высокая двигательная активность низкая двигательная активность высокая двигательная активность низкая двигательная активность
Слой III коры Слой V коры Хвостатое ядро Прилежащее ядро Гиппокамп (СА3) 0.71 ± 0.020 0.79 ± 0.019 0.54 ± 0.004 0.48 ± 0.013 0.92 ± 0.022 1.03 ± 0.009 1.11 ± 0.027 0.95 ± 0.015 0.92 ± 0.008 0.92 ± 0.042 0.56 ± 0.014 0.67 ± 0.011 0.56 ± 0.005 0.58 ± 0.007 0.81 ± 0.064 0.57 ± 0.008 0.74 ± 0.012 0.58 ± 0.004 0.6 ± 0.006 0.83 ± 0.048 0.76 ± 0.014 0.95 ± 0.010 0.77 ± 0.010 0.93 ± 0.006 1.28 ± 0.037 0.77 ± 0.002 0.99 ± 0.007 0.80 ± 0.007 0.99 ± 0.022 1.22 ± 0.031
Уровень активности ферментов выражен в условных единицах.
му уровню (рис. 2). А у крыс с низкой двигательной активностью наблюдается снижение уровня активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в нейронах слоя V сенсомоторной коры мозга (—16%). При этом в нейронах слоя III сенсомоторной коры, хвостатого ядра
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.