научная статья по теме ВЛИЯНИЕ ЛАЗЕРНОЙ ПЕРФОРАЦИИ БЛЕСТЯЩЕЙ ОБОЛОЧКИ НА ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ ЭМБРИОНОВ МЫШИ IN VITRO Химия

Текст научной статьи на тему «ВЛИЯНИЕ ЛАЗЕРНОЙ ПЕРФОРАЦИИ БЛЕСТЯЩЕЙ ОБОЛОЧКИ НА ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ ЭМБРИОНОВ МЫШИ IN VITRO»

БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 6, с. 911 - 919

УДК 577.34

ВЛИЯНИЕ ЛАЗЕРНОЙ ПЕРФОРАЦИИ БЛЕСТЯЩЕЙ ОБОЛОЧКИ НА ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ ЭМБРИОНОВ

МЫШИ in vitro

© 2015 Е.О. Захарченко1, АА. Залесский1, А.А. Осыченко1, А.С Кривохарченко1, А.К Шахбазян1, А.В. Рябова3, В.А. Надточенко1,2,4*

1 Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН, 119991 Москва; электронная почта: nadtochenko@gmail.com 2 Институт проблем химической физики РАН, Московская обл., 142432 Черноголовка 3 Институт общей физики им. А.М. Прохорова РАН, 119991 Москва

4 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, химический факультет, 199991 Москва

Поступила в редакцию 13.01.15 После доработки 23.02.15

Изучено влияние операции лазерной оптической перфорации блестящей оболочки (zona pellucida) эмбрионов мыши на их жизнеспособность и развитие. Лазерными импульсами с длиной волны генерации 1,48 мкм и длительностью 2 мс выполнены операции по утончению блестящей оболочки, перфорации одного или двух отверстий для эмбрионов на стадиях развития: двух бластомеров, морулы и бластоцисты. Изучено развитие мышиных эмбрионов до стадии бластоцисты и бластоцисты, вышедшей из zona pellucida. Полученные данные обрабатывали статистически с использованием Z-теста. Показано, что утончение или единичная перфорация блестящей оболочки эмбриона на стадии двух бластомеров или морулы не влияет на развитие эмбрионов до стадии бластоцисты и бластоцисты, вышедшей из zona pellucida, но ускоряет выход на один день по сравнению с контрольной группой in vitro. Оптоперфорация двух отверстий на стадии двух бластомеров или морулы несущественно влияет на вероятность образования бластоцисты, но резко понижает вероятность выхода из блестящей оболочки. Также негативный эффект имеет оптоперфорация на стадии бластоцисты, после этой операции выход из zona pellucida не наблюдался. Подсчет клеток в бластоцис-тах после перфорации одного отверстия на стадии двух бластомеров или морулы показал, что число клеток в эмбрионах, выходящих из zona pellucida или полностью вышедших из нее, не отличается от числа клеток в таких же контрольных группах. Этот факт указывает на то, что метод лазерной оптоперфорации одного отверстия является удобным и безопасным экспериментальным приемом для осуществления дальнейших манипуляций с эмбрионом внутри блестящей оболочки, таких как извлечение полярного тельца или внесение стволовых клеток под блестящую оболочку.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: биофотоника, фотобиология, лазерная оптоперфорация, эмбрион, лазерный хэтчинг.

Лазерные операции на клетках и эмбрионах — актуальное направление современной фотобиологии и биофотоники. Высокая плотность мощности остро сфокусированного лазерного излучения способна обеспечить эффективное воздействие света на вещество клетки или эмбриона. Точная фокусировка лазерного пятна обеспечивает строго контролируемую перфорацию мембран. Настоящая работа посвящена изучению влияния оптоперфорации блестящей оболочки эмбрионов млекопитающих с помощью остро сфокусированного лазерного излучения

* Адресат для корреспонденции.

на длине волны 1,48 мкм на дальнейшее развитие эмбриона. Такая лазерная операция предложена для использования в практике экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) и интраци-топлазматической инъекции сперматозоида в яйцеклетку (ИКСИ). Культивируемые in vitro яйцеклетки и эмбрионы часто имеют нарушение в процессе естественного выхода из блестящей оболочки — «хэтчинга», что снижает вероятность имплантации и наступления беременности [1]. Метод вспомогательного «хэтчинга» (от англ. assisted hatching) — искусственное нарушение целостности блестящей оболочки эмбриона при механическом или химическом воздей-

ствии, был предложен для увеличения имплантации эмбрионов в эндометрий матки [2]. Лазерная перфорация блестящей оболочки эмбриона — самый молодой метод вспомогательного «хэтчинга» [3, 4]. Использование лазера позволяет обеспечить высокую точность воздействия, стерильность и малую инвазивность, что делает лазер удобным инструментом для проведения микроманипуляций. Однако в настоящее время существуют неоднозначные результаты по использованию данного метода. Сообщается о значительном повышении вероятности наступления беременности при использовании вспомогательного хэтчинга [5, 6]. Также утверждают о негативном влиянии метода [7]. Существует мнение об отсутствии различий в группах с искусственной перфорацией и без нее [8, 9].

Цель данной работы — изучить влияние различных манипуляций на развитие эмбрионов in vitro до стадии бластоцисты и способность блас-тоцист выходить из блестящей оболочки, выявить эффективность различных методик лазерного вспомогательного «хэтчинга». Подсчет клеток проводили для оценки качества бласто-цист, развившихся in vitro после лазерной перфорации.

ного манипулятора, разработанного в ИХФ РАН. Принципиальная схема оптического блока, использованного в эксперименте, представлена на рис. 1. В оптический путь инвертированного микроскопа OLYMPUS IX71 по оптоволокну с микрообъективом на конце через дихроничес-кое зеркало заведено излучение диодного лазера («Thorlabs», США, длина волны X = 1,48 мкм, выходная мощность 500 мВт, мощность лазерного излучения в предметной плоскости составляла 110 мВт). Излучение подавали в виде импульса и/или последовательности отдельных импульсов. Длительность импульса лазера могли варьировать от 50 нс до 5 с с помощью управляющего блока питания лазера, разработанного на основе генератора импульсов («Thorlabs», США). Во всех экспериментах по перфорации использовали длительность импульса 2 мс. Излучение лазера фокусировали объективом Olympus 60х LUCPLFLN с числовой апертурой NA = 0,7. Диаметр пучка составил 2w0 = 1,22. X/NA = 2,58 мкм; продольный размер z0 = (nw0)2/X = 3,53 мкм [10], плотность энергии в области фокусировки составила 4,2 х 103 Дж/см2. Коэффициент поглощения воды для длины волны 1,48 мкм составляет 0,003 см-1 [11], при типичной использу-

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Получение эмбрионов. В экспериментах использовали самок мышей линии C57BL/6 и самцов линии CBA. Возраст животных составлял 1,5—2 мес. Для получения достаточного количества эмбрионов самок гормонально стимулировали. Для суперовуляции использовали гормоны: гонадотропин сыворотки жеребых кобыл («Intervet», США) и человеческий хорионичес-кий гонадотропин («Intervet», США). Гормоны (10 ед) вводили внутрибрюшинно с интервалом в 48 ч, предпочтительное время введения — вечер (16—18 ч). Это время выбирают исходя из того, что овуляция у мыши наступает спустя 10—13 ч после укола хорионического гонадотропина, это время примерно совпадает со временем спаривания самца с самкой (поздняя ночь—раннее утро). Эмбрионы выделяли на стадии двух бласто-меров (2-й день после оплодотворения) путем промывания яйцеводов. Для вымывания использовали среду М2 («Sigma», США). Манипуляции с эмбрионами производили в капле среды М2 на покровном стекле. Эмбрионы культивировали в четырехлуночных чашках («Nunc», США) в среде М16 в инкубаторе с 5%-ным содержанием СО2 при температуре 37°.

Лазерный перфоратор. Микрохирургические операции были выполнены на установке лазер-

Рис. 1. Блок-схема лазерной установки для перфорации. Элементы установки указаны на рисунке

емой длительности импульса 2 мс скачок температуры в перетяжке (в пятне диаметром 2,58 мкм) составлял ~75°. Управление X,Y- координатами столика микроскопа и длительностью лазерных импульсов осуществляли с помощью компьютера. Микрохирургию блестящей оболочки эмбрионов выполняли в области, максимально удаленной от бластомеров, таким образом, чтобы волна тепла, исходящая из пятна перетяжки после лазерного импульса, не травмировала бластомер. Используемый лазерный импульс приводил к образованию круглого отверстия размером 2 мкм. По заданной программе лазерное пятно перемещалось по полю блестящей оболочки, подавался импульс и таким образом последовательно происходила перфорация оболочки. Операции по лазерной перфорации осуществлялись на покровном стекле, на котором эмбрионы помещались в каплю среды М2 объемом 50 мкл. После лазерного воздействия эмбрионы помещали в четырехлуночные чашки со средой М16 и культивировали в СО2-инкубато-ре. Время операции не превышало 2 мин и эффекты, связанные с испарением капли, были не существенны.

Количество клеток в бластоцистах оценивали с помощью двух методов: приготовлением сухо-воздушных препаратов по Тарковскому и окраской Hoechst с последующей визуализацией на конфокальном флуоресцентном микроскопе. Для приготовления суховоздушных препаратов по методу Тарковского [12] использовали: гипотонический раствор NaCl, смесь метанола и ледяной уксусной кислоты в соотношении 3 : 1, раствор краски Гимза 7% («ПанЭко», Россия). На предметное стекло в каплю гипотонического раствора NaCl помещали эмбрион на ~5 мин. Когда гипотонический раствор почти полностью испарялся, на эмбрион наносили каплю фиксирующей смеси (ледяной уксусной кислоты и метанола). После испарения фиксатора стекло помещали в 7%-ный раствор краски Гим-за на 15 мин. Далее под микроскопом считали ядра бластоцист.

Конфокальная микроскопия. Окраску красителем Hoechst 33342 («Sigma», США) проводили в среде М16 в СО2-инкубаторе с содержанием краски 5 мкг/мл в течение 10—20 мин. Затем эмбрионы отмывали в среде, не содержащей краситель, и регистрировали флуоресценцию. Локализацию флуоресценции на вылупляющихся бластоцистах фиксировали с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа LSM-710-NLO («Jena», «Carl Zeiss Microscopy», Германия). Образцы из чашек для in vitro культивирования переносили на стерильные чашки Петри с тонким стеклянным дном

толщиной 0,16 мм в среде для манипуляций М2. Для получения изображений использовали объектив Plan_Apochromat с увеличением 20х (апертура 0,8). Двухфотонное возбуждение флуоресценции красителя Hoechst 33342 производили фемтосекундным лазером Chameleon Ultra II («Coherent», США) с длиной волны 770 нм и максимальной плотностью мощности 25 мВт, регистрировали флуоресценцию в диапазоне 400—550 нм при конфокальной диафрагме диаметром 600 ^м. Для получения изображени

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Химия»