БИОФИЗИКА, 2010, том 55, вып.1, с.25-31
МОЛЕКУЛЯР НАЯ БИОФИЗИКА =
УДК 577.3
ВЛИЯНИЕ ЛЕЦИТИНА НА ЭФФЕКТИВНО СТЬ ИНГИБИРОВАНИЯ а-ТОКОФЕР ОЛОМ ОКИСЛЕНИЯ МЕТИЛОЛЕАТА
© 2010 г. Л.И. Мазалецкая, Н.И. Шелудченко, Л.Н. Шишкина
Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, 119334, Москва, ул. Косыгина, 4
Е-mail: Ит@$ку.сНрЬ.га$.ги Поступила в p едакцию 27.03.08 г. После доработки 26.12.08 г.
Установлено, что влияние лецитина на процесс окисления метилолеата зависит от скорости генер ации свободных р адикалов: лецитин не изменяет скорость реакции при высоких скор о стях образования радикалов (инициированное окисление) и ускоряет окисление при низких скор о стях (автоокисление), вызывая уменьшение периода индукции. Ингибирующее действие смесей лецитина и природного антиоксиданта а-токоферола зависит от концентраций как а-токоферола, так и лецитина при разных скор о стях окисления. Ингибирующий эффект смесей с низкими концентрациями а-токофер ола близок к аддитивному. Увеличение его концентрации в смеси приводит к росту синергического эффекта. В области высоких концентраций а-токоферола величина синер гического эффекта экстр емально зависит от концентр ации лецитина. Обсуждается механизм эффекта синергизма смесей а-токофер ола с лецитином.
Ключевые слова: лецитин, а-токоферол, метилолеатная модель, автоокисление, инициированное окисление, синергизм.
Механизм ингибирования реакций окисления органических веществ индивидуальными синтетическими и природными соединениями подробно рассмотр ен в обзор ах и моногр афиях [1—8]. Однако детальный механизм окислительных процессов с участием природных компонентов клетки до сих пор изучен недостаточно. Суммарная антиокислительная активность сложных систем зависит от начальной концентр ации антиоксидантов (АО), их антирадикальной активности, от наличия в системе веществ, влияющих на эффективность ингибирующего действия АО, а также от степени ненасыщенности суб стр ата окисления [9-11], соотношения компонентов в смеси [11,12] и скорости зарождения р адикалов в окислительных процессах [13]. Взаимодействие компонентов в сложных системах может приводить к появлению синергизма или антагонизма, величина которых сильно колеблется, в частности, в зависимости от пр одолжительности процесса окисления [11,14].
Сложность механизма действия смесей пр и-родного АО - а-токоферола (ТФ) - с одним из компонентов клеточных мембран животных
Сокращения: АО - антиоксидант, ТФ - а-токоферол, ФХ - фосфатидилхолин, ФЛ - фосфолипиды, НФФД -К-нафтил-К '-фенил-п-фенилендиамин, СЭ - синергический эффект.
и человека фосфатидилхолином (Ф X) отмечена при инициированном окислении метилолеата [15]. Показано, что при добавлении ФX к а-токоферолу наряду с увеличением периода индукции (т) на начальных стадиях р еакции имеет место увеличение скорости окисления в присутствии смеси по сравнению с ТФ, которое наблюдается с увеличением начальных концентр аций компонентов смеси и степени окислен-ности модельного субстрата.
Широкое использование лецитина, основным компонентом которого является фосфати-дилхолин, в качестве биологически активной добавки обусловливает необходимость детального изучения его влияния на эффективность природных антиоксидантов.
Целью настоящей работы является изучение влияния лецитина на скорость окисления модельного субстрата - метилолеата - при различных скоростях генерирования свободных радикалов, а также на эффективность ингибирую-щего действия природного антиоксиданта - а-токофер ола.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Скорость генерирования свободных радикалов вар ьировали проведением процесса окисления в разных условиях. Автоокисление метил-
0.16
[-Н
0.12
л
§
§ 0.08
X
О
О tí 0.04
°'000 50 100 150 200 250 300 350
Время, ч
Pис. 1. Кинетические кривые накопления гидропе-роксида при автоокислении метилолеата (323 К) без добавок (1) и в присутствии: 2,5 мг/мл лецитина (2); 1-10-4 моль/л ТФ (3); 1-10-3 моль/л ТФ (4).
олеата проводили в тонком слое кислородом воздуха пр и 323 К. а-Токофер ол вводили в метилолеат в р а створ е этилового спир та. Чтобы исключить влияние хлор офор ма пр и введении лецитина, хло р офор м пр едвар ительно удаляли, а о ставшийся лецитин р астворяли в спир те. И сходная доля спир та в общем объеме р еак-ционной смеси во всех опытах была постоянной и со ставляла 4%. За ходом окисления следили по накоплению гидр опер оксидов (ROOH), концентр ацию котор ых опр еделяли методом иодо-метрического титрования. Ошибки измерения концентр ации пер оксидов не пр евышали 1,5%.
Инициир ованное динитр илом азоизомасля-ной кислоты окисление метилолеата проводили при 333 К с использованием волюмометриче-ского метода поглощения кислор ода. Метилолеат в смеси с инертным растворителем хлорбензолом (1:1) и р а створ енным инициато р ом тер мостатир овали, после чего вводили добавки исследуемых соединений. Лецитин и ТФ вводили в растворе хлороформа. Электронные спектры поглощения регистрировали на спектр офотометре Бресогё UV-vis (Германия).
Метилолеат очищали пер егонкой в вакууме, а-токоферол (Sigma, CША) и лецитин из яич-ны х желтков в ра створ е хлор офор ма в концентр ации 50 мг/мл (Serva, США), использовали без дополнительной очистки. Качественный и количественный со став его фо сфолипидов определяли методом одномерной тонкослойной хроматографии, подробно описанном в [10]. Экспер именты повтор яли тр ижды. С татистиче-скую обр аботку р езультатов пр оводили общепринятыми методами вариационной статистики. В таблицах р езультаты пр едставлены в виде
ср едних ар ифметических значений с указанием их среднеквадратичных ошибок.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Как известно, лецитин является смесью пр ир одных липидов. Хр оматогр афический анализ показал, что в использованном в наших экспе-р иментах пр епар ате в со ставе общих липидов содержалось 56,0 ± 1,4% фо сфолипидов (ФЛ), из которых 96,6 ± 0,2% составлял ФX; 1,5 ± 0,1% - лизоформы ФЛ; 0,45 ± 1,4% - фосфа-тидилэтаноламин; 0,9 ± 0,2% - сфингомиелин, а 0,55% - суммарное количество фосфатидил-инозита, фосфатидилсерина, кардиолипина и фосфатидной кислоты. Следовательно, содержание Ф X в со ставе лецитина со ставляет около 54%, что подтверждено спектрофотометриче-ски.
П р оцесс автоокисления пр отекает с весьма низкими скор о стями зар ождения цепей (^0). С кор о сть W 0 опр еделяли с помощью высокоактивного антиоксиданта - М-нафтил-№ '-фенил-я-фенилендиамина (НФФД). По скор о сти накопления пр одукта окисления НФФД - М-наф-тил-№'-фенил-я-хинондиимина (^Хд) вычисляли значение W0 = fWXД = 1,9 • 10-10 моль/л-с, где f = 2 - стехиометрический коэффициент ингибир ования НФФД.
П р и автоокислении метилолеата в отсутствие и в присутствии добавок на кинетических кривых накопления Я ООН наблюдаются два участка, р азличающиеся по скор о сти накопления гидр опер оксида (р и с. 1). Длительность первого участка (период индукции, т) изменяется пр и введении добавок в окисляющийся метилолеат (р ис. 1, кр ивые 2-4). Известны различные спо собы опр еделения т [13,16,17]. Так, в работе [17] за т пр инимали вр емя, в течение котор ого накапливается заданная концентрация ЯООН, равная 0,02 ммоль/мг. Такой способ оценки т оправдан в случае практического использования ТФ для стабилизации пищевых и лекарственны х пр епар атов, когда имеет место огр ани-чение по количеству накопившихся в процессе хр анения гидр опер оксидов, а также если после до стижения указанной концентр ации ЯООН наблюдается пер еход к максимальной скор о сти окисления.
На рис. 1 видно, что лецитин (кр ивая 2) и ТФ (кр ивые 3, 4) р азличным обр азом влияют на величину т: лецитин ускор яет автоокисление метилолеата, добавки ТФ приводят к значительному увеличению т. При этом после достижения концентрации ЯООН, равной 0,02
т,ч 500400-
зоо-200-юо -7
°0.0 0.5 1.0
[ТФ]0хЮ3, моль/л
Рис. 2. Зависимости периода индукции (т) при автоокислении метилолеата (323 К) от начальной концентрации ТФ в отсутствие (1) и в присутствии 2,5 мг/мл лецитина (2).
ммоль/мг, в случае и спользования высоких концентр аций ТФ (кривая 4) окисление еще в течение весьма пр одолжительного вр емени пр о -текает с низкими скор о стями, т .е. тор мозящее действие АО пр одолжается. По этой пр ичине был использован графический способ определения пер иода индукции, как наиболее полно отр ажающий механизм действия АО. За т пр и-нимали отр езок вр емени от нуля до пер пенди-кулярной проекции на ось времени точки пересечения двух линейных участков кинетической кр ивой накопления ЯООН, соответствующих начальной скор о сти внутр и пер иода индукции и максимальной скор о сти обр азования ЯООН.
Для зависимости т от [ТФ]0 наблюдается отклонение от линейности (рис. 2, кривая 1), пр и этом величины пер иода индукции для концентр аций ТФ, равных 5-10-4 и 1-10-3 моль/л, со ставляют 300 и 293 ч соответственно. Подобная зависимость т от начальной концентрации АО хорошо известна для ТФ и ряда синтетических антиоксидантов, механизм действия которых сопровождается протеканием побочных реакций, приводящих к непроизводительному р а сходованию АО и генер ации свободных р а -дикалов [18,19].
Следует отметить, что в соответствии с данными работы [16], скор о сти накопления ЯООН на первом участке кинетической кривой имеют тенденцию к возрастанию с ростом начальной концентр ации ТФ (рис. 1, кривые 3, 4), что обусловлено совокупностью побочных реакций, пр иводящих к пр одолжению цепей окисления.
Таблица 1. Величина т пр и автоокислении метилолеата в пр исутствии лецитина, 323 К
Начальная концентр а -ция лецитина, мг/мл Пер иод индукции т, ч
- 25 ± 1,00
0,25 21 ± 0,80
0,50 18,5 ± 0,70
2,50 16,5 ± 0,65
5,00 15,5 ± 0,60
Поэтому если за т пр инимать вр емя, пр и котором достигается заданная концентрация ЯООН, то зависимость т от [ТФ]0 может измениться и, в частности, максимальный пер иод индукции будет смещаться в область более низких концентраций ТФ.
В отличие от ТФ добавки лецитина в интер вале 0,25 - 5 мг/мл уменьшают т окисления метилолеата в 1,2-1,4 р аза, пр ичем наблюдаемое снижение пер иода индукции имеет более резкий
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.