ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 577.158:616.831-005
ВЛИЯНИЕ ЛИТИЕВОЙ СОЛИ ГАМК НА СУБКЛЕТОЧНЫЙ МЕТАБОЛИЧЕСКИЙ ПРОФИЛЬ L-АРГИНИНА В ПРЕФРОНТАЛЬНОЙ КОРЕ И СТРИАТУМЕ КРЫС ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ СТРЕССЕ
© 2012 г. Н. С. Назарян1, С. А. Казарян2, Н. О. Мовсесян1, Н. Х. Алчуджян1, *, О. А. Мовсесян1, Р. Л. Айрапетян1, К. А. Барсегян1, Г. А. Геворкян1
Институт биохимии им. Г.Х. Бунятяна НАН РА, Ереван, Армения 2Институт тонкой органической химии им. А.Л. Мнджояна НАН РА, Ереван, Армения
Описанное нами ранее депрессивноподобное поведение крыс, вызванное 14-дневным непредсказуемым воздействием ряда стрессирующих факторов, сопровождается устойчивым повышением содержания Ь-аргинина и оксида азота (N0) и его стабильных метаболитов, а также стимулированием индуцибельной изоформы N0 синтазы ^N08) и подавлением общей активности ее конститутивных изоформ ^N08) в цитозоле и митохондриях префронтального кортекса (ПФК) и стриату-ма. Одноразовая внутрибрюшинная инъекция на второй день постстрессового периода литиевой соли ГАМК (в дозе 0.9 мг/кг) нормализует содержание Ь-аргинина и активных форм азота в исследуемых компартментах ПФК и стриатума, и, хотя не оказывает существенного влияния на стрес-синдуцированные сдвиги активности сN0S, предотвращает устойчивое стимулирование системы iN0S/N0 в митохондриях, препятствуя гиперпродукции N0 и развитию нитрозирующего стресса, ведущих к нарушению энергетических процессов в вышеуказанных отделах мозга.
Ключевые слова: Ь-аргинин, литиевая соль ГАМК, митохондрии, префронтальный кортекс, синтаза оксида азота, стриатум, хронический стресс, цитозоль.
ВВЕДЕНИЕ
Согласно статистике ВОЗ, к наиболее распространенным психическим заболеваниям относятся депрессия и патологическая тревога, от которых страдает до 25% всего населения мира [1]. Хронический стресс (ХС) вызывает значительные нейрохимические, морфологические и функциональные изменения в головном мозге, способствуя развитию депрессии и тревожных расстройств [2]. Накоплены данные, свидетельствующие о признаках митохондриальной дисфункции при психических заболеваниях, а также о нарушениях психики при "митохондриальных болезнях", связанных с нарушениями клеточного энергообмена [3, 4]. В этой связи особый интерес представляет универсальный биомессенджер оксид азота (N0), который является одним из важнейших полифункциональных регуляторов процессов, протекающих в митохондриях [5]. N0 относят к новому семейству сигнальных молекул со свойствами нейро-трансмиттера, он регулирует секрецию дофамина, норадреналина, серотонина, ацетилхолина, ГАМК, возбуждающих аминокислот, глутамата и аспартата, оказывая модулирующее влияние на
* Адресат для корреспонденции: 0014 Ереван, ул. П. Севака, 5/1, Республика Армения, е-таП: alchujyan@mail.ru.
процессы синаптической передачи, процессы обучения и памяти, влияя на механизмы долговременной потенциации и депрессии [6, 7], реализуемые прежде всего в гиппокампе, префронтальной коре (ПФК) и в вентральном стриатуме (прилежащее ядро), которые участвуют в формировании эмоций и консолидации памяти, входят в мезо-кортико-лимбическую дофаминовую систему и модулируют ответ на ХС, обеспечивая адаптационные способности организма [8].
Эндогенный синтез NO из L-аргинина осуществляется ферментом NO синтазой (NOS), которая представлена в головном мозге ее основными изоформами: кальций-кальмодулинзависимыми "конститутивными" NOS ^NOS). Нейрональная сNOS участвует в механизмах нейротрансмиссии и в разных сигнальных путях. Эндотелиальная сNOS регулирует сосудистый тон, кровоток и тканевую перфузию. Кальций-кальмодулиннеза-висимая "индуцибельная" NOS (iNOS) — эффек-торная молекула врожденной иммунной системы [9]. Недавно была открыта митохондриальная сNOS, которая участвует в обратимом ингибиро-вании цитохром оксидазы, функционально связана с комплексом I митохондриальной дыхательной цепи, при инактивации которого наблюдается прооксидантное действие [10]. В интактных мито-
хондриях и субмитохондриальных мембранах дофамин повышает активность NOS и выброс NO, ингибируя цитохром оксидазу, подавляя клеточное дыхание и вызывая деполяризацию мембран и ми-тохондриальную дисфункцию с нарушением обратного захвата медиаторов (катехоламинов, серо-тонина и др.) [11, 12].
Система NO/NOS лежит в основе психопатологических сдвигов, наблюдаемых при стрессе, аффективных расстройствах, включая депрессию [13, 14]. Рассматриваются возможности использования изоформ NOS в качестве терапевтических мишеней при депрессии [15]. При этом необходим избирательный подход с учетом разнонаправленных эффектов функционально различающихся сNOS и iNOS, которые проявляются и в отношении их влияния на процессы нейрогенеза и на регуляцию активности ядерного транскрипционного фактора, задействованных в механизмах развития депрессии при ХС [16, 17].
Тем не менее при депрессивных состояниях практически не изучен вклад изоформ NOS в процессы продукции NO внутри клеточных компарт-ментов, a также их связь с субклеточным содержанием субстрата и продуктов NO синтазной реакции, L-аргинина и активных форм азота соответственно, которые влияют на энергообмен и мембранную проницаемость митохондрий, выход из них кальция в цитозоль, процессы, регулирующие выброс и обратный захват нейротрансмитте-ров [12, 15]. Исходя из вышеизложенного, целью настоящего исследования является изучение уровня L-аргинина и активности сNOS и iNOS в митохондриях и цитозоле ПФК и стриатума при де-прессивноподобном поведении (ДПП) крыс, индуцированном ХС.
Последние работы свидетельствуют о том, что в антидепрессантные эффекты ГАМК и лития вовлечена система NOS/NO [18, 19]. Однако хроническое лечение литием депрессии, биполярных расстройств может вызывать интоксикацию, сопровождающуюся персестирующими ступором, тремором, лихорадкой и олигурией [20]. Для предотвращения подобных негативных последствий в целях снижения дозы и повышения эффективности лечения создаются комплексные препараты, к которым относится литиевая соль ГАМК, влияние которой на интрацеллюлярное содержание L-аргинина и изоформ NOS в головном мозге крыс при ХС-индуцированном ДПП изучается впервые и результаты также представлены в данной работе.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Животные. Опыты осуществлялись с соблюдением правил содержания и обращения с животными, изложенных в Директивах Европейского Со-
общества (86/609/ЕС) и одобренных Комитетом по биомедицинской этике при Институте биохимии им. Г.Х. Бунятяна НАН РА. Эксперименты проводили на половозрелых белых крысах-самцах линии Вистар массой 100—140 г, которые содержались в виварии в условиях естественного освещения и свободного доступа воды и пищи. Животные были разделены на группы (по 18 животных в группе): контрольная группа — здоровые крысы и три опытные группы: в первой — крысы, подвергнутые воздействию стрессирующих факторов, были де-капитированы сразу после 14-дневного ХС; в остальных двух группах крыс декапитировали одновременно, через 4 дня после ХС. При этом за два дня до декапитации в одной из групп животные получили одноразовую внутрибрюшинную инъекцию (0.3 мл) литиевой соли ГАМК в дозе 0.9 мг/кг, а параллельная группа необработанных стрессиро-ванных крыс служила "контролем" для оценки влияния препарата.
Хронический стресс. ХС осуществляли по описанной ранее собственной методике, в результате чего у крыс развивается ДПП [21]. Вкратце: ежедневно в течение 14 дней животных подвергали воздействию одного или двух стрессирующих процедур из шести, которые для предотвращения предсказуемости повторялись через каждые два дня с разной длительностью воздействия. При этом в принятой животной модели депрессии человека на основе мягкого непредсказуемого стресса [22, 23] нами был сокращен стрессорный период с 3-х и более недель до двух, и в целях усиления стрессирующих условий наряду с такими рекомендуемыми факторами, как принудительное плавание, лишение пищи и иммобилизационный стресс, были включены вдыхание паров эфира, холодовой и ортостатический стресс (и исключены другие — нарушение смены дня и ночи, изоляция и пр.).
Выделение структур мозга и клеточных ком-партментов. Животных декапитировали, на льду из головного мозга извлекали ПФК и стриатум и гомогенизировали в гомогенизаторе Поттера (1500 об/мин) в течение 3 мин в 10ти кратном объеме 20 мМ HEPES буфера, содержащего 0.25 М сахарозу, рН 7.4. Гомогенат центрифугировали на центрифуге К-24 (Германия) при 3000 об/мин 10 мин при 4°С с осаждением ядерной фракции, и из полученной надосадочной жидкости последующим центрифугированием при 15000 об/мин 20 мин при 4°С получали в супернатанте цитозоль-ную фракцию и в осадке — митохондриальную, обогащенную нейронами и глией [24].
Содержание NO и его стабильных метаболитов.
В пробах перед определением осаждали белки, с добавлением 0.5 N NaOH и 10% ZnSO4 (в пропорции 1 : 1 : 1 по объему) с последующим центрифугированием при 15000 об/мин 3 мин при комнатной температуре на настольной микроцентрифуге
фирмы Eppendorf (США). В супернатантах депро-теинизированных проб определяли содержание так называемых активных форм азота (АФА), то есть NO и его стабильных интермедиатов — окислов азота ( NO-, NO-, N2O4, N2O3), нитрозотио-лов и нитрозаминов реакцией диазотирования с использованием свежеприготовленного реактива Грисса-Илосвая (0.3% раствор сульфаниловой кислоты в 30% уксусной кислоте смешивали перед опытом с 0.1% раствором альфа-нафтиламина в 4.4% уксусной кислоте, в пропорции 1 : 1 по объему), который добавляли к пробам в соотношении
1 : 1 по объему, смешивали и спустя 15 мин спек-трофотометрировали при длине волны 546 нм [25].
Содержание АФА выражали в нмоль (NO- ) /мг белка. Концентрацию нитритов рассчитывали по калибровочной кривой для NaNO2 (2-200 нМ).
Активность NOS определяли по аккумуляции АФА после длительной инкубации проб (24 ч, 37°С) в 20 мМ HEPES буфере, pH 7.4, содержащем
2 мМ дитиотреитол, 3 мМ MgCl2 • 6H2O в присутствии 5.3 мМ L-аргинина, 0.2 мМ NADPH, 20 мкМ (6R)-5,6,7,8-тетрагидробиоптерина, 6 мкМ FAD и 5.5 мкМ FMN. Общая активность NOS определялась при инкубации проб в присутствии 1.7 мМ C
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.