ХИМИЧЕСКАЯ ФИЗИКА, 2014, том 33, № 7, с. 64-73
ХИМИЧЕСКАЯ ФИЗИКА БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ
УДК 577.3
ВЛИЯНИЕ МАЛЫХ ЛИГАНДОВ И ИХ КОМПЛЕКСОВ НА СВОЙСТВА БЕЛКА ЛИЗОЦИМА © 2014 г. К. Б. Терешкина, А. С. Степанов, Д. О. Синицын, Ю. Ф. Крупянский*
Институт химической физики им. Н.Н. Семенова Российской академии наук, Москва
*Е-таП: yufk@chph.ras.ru Поступила в редакцию 24.12.2013
В настоящей работе экспериментальными и теоретическими методами исследована структура комплексов алкилированных оксибензолов — 4-гексилрезорцина, 5-метилрезорцина и тирозола. Изучено влияние 4-гексилрезорцина и 5-метилрезорцина в большом диапазоне их концентраций на структуру, равновесные флуктуации и функциональную активность водорастворимого фермента лизоцима. Построена пространственная модель взаимодействия молекул лигандов и их кластеров с белком и водным окружением. Предложен возможный механизм стабилизации третичной структуры белка указанными молекулами.
Ключевые слова: 5-метилрезорцин, 4-гексилрезорцин, тирозол, малые лиганды, стабилизация белков, химические шапероны.
Б01: 10.7868/80207401X14070139
1. ВВЕДЕНИЕ
Работа посвящена проблеме изучения механизма стабилизации белковой глобулы малыми лигандами, называемыми химическими шаперо-нами (ХШ) [1, 2]. Подобные задачи возникают и при изучении самоорганизации (сворачивания) полипептидной цепи в нативную структуру. Известно множество заболеваний, сопряженных с неправильным сворачиванием белковых глобул, таких как прионные болезни, болезни Альцгей-мера, Паркинсона, рак, диабет и др. [3—5]. Существуют многочисленные научные данные по стабилизации белков и пептидов химическими ша-перонами, самыми известными из которых являются криопротектор глицерин и некоторые другие полиолы, осмопротектор триметиламин-М-оксид (ТМАО), диметилсульфоксид (ДМСО), некоторые аминокислоты (глицин, бетаин) и сахара (например, трехалоза) [1, 6, 7].
Алкилрезорцины входят в группу алкилокси-бензолов — биологически активных веществ микробного и растительного происхождения, встречающихся у бактерий, грибов, лишайников, растений [8]. Так, 5-метилрезорцин (орцинол) в природе встречается у многих видов лишайников. Орцинол находит свое биологическое применение в составе веществ, обладающих антиокси-дантной и антибактериальной активностью [9]. Изучение алкилоксибензолов представляет собой актуальную научную задачу в связи с тем, что эти соединения обладают широким спектром дей-
ствия как на клетки биологических организмов, так и на отдельные белковые молекулы [8, 10]. Они находят применение в биотехнологии для стабилизации и активации гидролитических ферментов, в частности лизоцима [11—13], а также в химической промышленности — при производстве резины.
В настоящей работе рассмотрен ряд алкилиро-ванных оксибензолов, которые, как предполагается, могут быть отнесены к классу химических шаперонов [14—16]. Ранее авторами изучалась проблема влияния алкилоксибензолов на структурно-динамические особенности белков [11, 12]. В настоящей работе обсуждается новый подход к проблеме стабилизации белковых глобул и функционированию белка-фермента, основанный на образовании кластеров малых лигандов и их гидратов при осуществлении механизмов стабилизации белков. Определены основные сайты связывания 5-метилрезорцина на поверхности лизоцима.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1. Изучение изменений структуры белка
Изменение структуры лизоцима при взаимодействии с химическими шаперонами при различных концентрациях изучалось методом диффузного рассеяния рентгеновских лучей (ДРРЛ). Более подробная информация о методе изложена в работах [17, 18]). Используемая в работе установка по диффузному рассеянию рентгеновских
лучей позволяла снимать индикатрисы рассеяния в интервале углов от 3 до 80°. Нахождение функции радиального распределения атомов с помощью интегрального фурье-преобразования данных интенсивности ДРРЛ в данной работе проводилось в одноатомном (моноатомном) приближении [18]. Это приближение дает весьма хорошие результаты и позволяет улавливать слабые изменения структуры (около 0.1 А) [18], что практически невозможно сделать с помощью обычного рент-геноструктурного анализа кристаллизованных белков. Напомним, как определяется сферически-симметричная функция распределения расстояний между атомами р(г) [19—23]. Функция р(г) определяется так, что величина 4т2р(г)& есть среднее число атомов, находящихся на расстояниях между г и г + йг от центра отмеченного атома.
Диффузное рассеяние рентгеновских лучей на малых углах весьма чувствительно к изменению формы макромолекулы и ее радиуса гирации при внешних воздействиях [24, 25]. Поэтому увеличение свободного объема в глобуле белка (или увеличение радиуса гирации) достаточно легко проверить с помощью малоуглового рассеяния рентгеновских лучей. Этот факт использовался нами ниже при обсуждении результатов.
Изменение равновесных флуктуаций атомов в лизоциме при взаимодействии его с ХШ изучалось методом упругого рэлеевского рассеяния мессбауэровского излучения (РРМИ). Этот метод изучения флуктуаций в белках играет заметную роль среди современных физических методов [26]. Он представляет собой комбинацию диффузного рентгеновского рассеяния и мессбауэровской спектроскопии и обладает рекордным энергетическим разрешением, равным разрешению месс-бауэровской спектроскопии. Изучение динамики белков в данной работе проводилось вышеописанным методом с использованием мягких условий коллимации. Ширина функции углового распределения составляет 8 град. В этом варианте нами уже изучалась доля упругого рассеяния для различных белков и спектры РРМИ [27—31]. Мягкие условия коллимации позволяют значительно увеличить скорость счета (набираемую статистику) и использовать при интерпретации экспериментальных данных так называемое "некогерентное" приближение. В этом случае интенсивность рэлеевски (упруго) рассеянных у-квантов на увлажненном и окруженном ХШ белке можно с точностью до 20—30% [27—31] полагать равной сумме интенсивностей у-квантов, рассеянных на молекулах белка, молекулах растворителя и молекулах ХШ. Тогда суммарная измеряемая доля упругого рассеяния является аддитивной составляющей долей упругого рассеяния отдельных компонент: /р, и (Подробнее см. оригинальные статьи [27—31]). Суммарная измеряемая доля
упругого рассеяния f нам известна, поведение упругой доли для гидратной воды нам известно достаточно хорошо (см. оригинальные работы и обзоры по динамике гидратной воды [28, 30—35]). В результате доля упругого рассеяния для лизоци-ма, окруженного, например, молекулами метил-резорцина, fp, существенно зависит от доли упругого рассеяния для метилрезорцина, fs. Оказалось, что непосредственные измерения зависимости доли упругого рассеяния метилрезорцина от степени его гидратации мало подходят для изучения поведения fp в тройной системе белок—гидратная вода — лиганд. Поэтому динамические свойства метилрезорцина моделировались с учетом его сильной вращательной диффузии при степени гидратации лизоцима h = 1. Учет вращательной диффузии химических шаперонов вносит дополнительную большую ошибку в определение амплитуды среднеквадратичных смещений собственно белка. Кроме этого, сама глобула лизоцима при столь сильной степени гидратации h = 1, существенно большей 0.6, при которой можно было пренебрегать движением глобулы как целого [27—31], может начать участвовать в либрационных движениях, амплитуду и время корреляции которых оценить крайне трудно. Данные движения дополнительно увеличивают ошибку определения амплитуды внутриглобулярных среднеквадратичных смещений собственно белка, которую авторы оценивают в 50—60% от величины амплитуды.
2.2. Изучение конформационной лабильности систем белок—вода—малые лиганды, а также кластеров и гидратов малых лигандов
Для определения конформационных изменений в системах, содержащих лизоцим и малые ли-ганды в различных концентрациях, был использован классический метод молекулярной динамики [33—35]. При изучении структуры кластеров и гидратов алкилоксибензолов и разработке силовых полей этих систем были использованы методы квантовой механики. Молекулярно-дина-мическое моделирование орцинолсодержащих систем проводилось в программном комплексе GROMACS [36] методом классической молекулярной динамики. Использовалось полноатомное силовое поле OPLS-AA. Шаг интегрирования составлял 1—2 фс. "Длина" траекторий составляла 30—100 нс для разных концентраций 5-метил-резорцина.
Параметры силового поля для 5-метилрезор-цина определялись с помощью расчетов ab initio в программном комплексе FIREFLY (называемый ранее PC GAMESS) [37]. Расчеты проводились методом Хартри—Фока. Для аппроксимации электростатического потенциала с целью нахождения парциальных атомных зарядов использовался расширенный базисный набор, со-
держащий поляризационные и диффузные функции, 6-311++G(d,^), был использован алгоритм поиска электростатического потенциала GEODESIC. Необходимые внутри- и межмолекулярные константы находились с использованием наборов базисных функций 6-311G(J,^) и 6-31G(J). Далее проводили процедуру усреднения зарядов для симметричных атомов и их параметризацию для силового поля OPLS-AA. Для сравнения результатов наших расчетов с расчетами параметров известных малых лигандов, значения параметров для триметиламин оксида (ТМАО) и мочевины брались из работы [38].
Были изучены системы, содержащие различное количество молекул 5-метилрезорцина на кубическую ячейку с ребром 7.1 нм. В центр ячейки помещалась молекула лизоцима (PDB ID 1AKI [39], 3HTB [40]), вокруг нее в случайном порядке — молекулы 5-метилрезорцина, далее ячейка заполнялась водой. Были исследованы системы, содержащие от 1 до 880 молекул 5-метилрезорцина. В качестве контроля были рассчитаны системы, состоящие из лизоцима и воды и из 5-метилре-зорцина и воды, а также системы, содержащие лизоцим, ТМАО или мочевину и воду. Использовались модели воды TIP3P и TIP4P. Проводились оптимизация энергии систем и начальная релаксация в течение 200 пс в NVT- и NPT-ансамблях.
Отдельно рассчитывались системы, состоящие из нескольких молекул 5-метилрезорцина, 4-г
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.