ОНТОГЕНЕЗ, 2009, том 40, № 6, с. 466-469
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ =
УДК 591.746:591.3:611-013
ВЛИЯНИЕ МЕЛАТОНИНА НА РЕГЕНЕРАЦИЮ ПЛАНАРИЙ Girardia tigrina
© 2009 г. О. Н. Ермакова, А. М. Ермаков, X. П. Тирас, |В. В. Леднев
Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН 142290 Пущино, Московская обл., ул. Институтская, д. 3 E-mail: ao_ermakovy@rambler.ru Поступила в редакцию 02.02.09 г. Окончательный вариант получен 09.04.09 г.
Исследовано влияние мелатонина на регенерацию головной и хвостовой частей планарий Girardia tigrina. Оценивали также изменение митотической активности стволовых клеток планарий - необ-ластов - в головной и хвостовой постбластемах под воздействием этого индоламина. Показано, что мелатонин в физиологических концентрациях (10-10-10-5 М) способен ингибировать регенерацию головной части планарий посредством подавления митотической активности необластов. Установлено, что этот гормон не влияет на рост хвостовой бластемы планарий, проявляя таким образом ди-стопроксимальный эффект воздействия на регенерацию.
Ключевые слова: планарии, регенерация, мелатонин, необласты.
Пресноводные плоские черви планарии (Platy-helmintes, Turbellaria, Tricladida) известны своей уникальной способностью к восстановлению утраченных частей тела путем регенерации. Регенерация этих животных осуществляется за счет пролиферации и дифференцировки стволовых клеток - необластов. Планарии представляют собой удобный объект для проведения фундаментальных исследований в области регенерации, морфогенеза и биологии стволовых клеток (Sanchez Alvarado et al., 2002). Известно, что пролиферация необластов и регенерация контролируются многочисленными как эндогенными, так и экзогенными факторами различной природы. Среди них выделяют особый класс биологически активных веществ, контролирующих процессы развития и роста, которые называются мор-фогенами. Они могут быть пептидной (морфоген гидры, эндорфины и т.д.) и непептидной природы (серотонин, ретиноиды), а также оказывать стимулирующее или ингибирующее действие на регенерацию планарий (Шейман и др., 1989; Тирас и др., 1996).
Мелатонин (К-ацетил-5-метокситриптамин) -индоламин, который синтезируется практически во всех живых организмах, включая бактерии. Он выполняет многочисленные физиологические функции, основные из которых - антиоксидантная защита и регуляция биологических ритмов (Hardeland, Poeggeler, 2003). В теле планарий мелатонин был обнаружен, показана его роль в регуляции бесполого размножения, а также изучен циркадный ритм его биосинтеза в голове этих животных (Morita et al., 1987). При высоких концентрациях (10-3 М) мелато-
нин приводит к гибели 50% животных и одновременно ингибирует регенерацию у оставшихся планарий. При этом было зафиксировано подавление регенерации как головного, так и хвостового отделов регенерантов. Снижение концентрации мелатонина до 7 х 10-4 M выявило дистопроксимальную зависимость от мелатонина - специфическое торможение регенерации головного конца тела. Дальнейшее снижение концентрации мелатонина до 10-4 M полностью снимало тормозной эффект гормона на регенерацию (Yoshizawa et al., 1991). Таким образом, мелатонин, по-видимому, является морфогенетически активным веществом, оказывающим специфическое влияние на регенерацию планарий. Однако применение высоких (летальных и сублетальных) концентраций этого гормона не позволяет сделать однозначное заключение о его специфическом действии на регенерацию.
Цель нашей работы - исследование проксимоди-стальной зависимости действия мелатонина в физиологических концентрациях на регенерацию пла-нарий.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Исследование выполнено на бесполой расе пресноводных плоских червей планарий Girardia tigrina (Girard, 1850). Животных содержали в прудовой воде при комнатной температуре и кормили раз в неделю личинками двукрылых. Для экспериментов отбирали планарий длиной около 10 мм и прекращали их кормление за 7 сут до опытов. Регенерацию головы вызывали ампутацией 1/5 части
тела планарии, содержащей головной ганглии; хвостовую часть тела ампутировали на расстоянии 1-2 мм от конца тела животного. Мелатонин в растворе этанола добавляли непосредственно после де-капитации в стаканы с водой, в которые помещали декапитированных животных. Стоковый раствор мелатонина (2 мг/мл) готовили следующим образом: навеску гормона растворяли в 30 мкл этанола и затем доводили дистиллированной водой до 1 мл. Вода контрольных групп планарий содержала этанол, равный его концентрации в воде опытных групп. Конечные концентрации этанола для планарий во всех группах были нетоксичными. Температуру воды, равную 21°С в экспериментальном и контрольном стаканах, поддерживали с одинаковой с точностью ±0.5°С. Эксперименты каждой серии повторяли не менее трех раз. Статистическую обработку и анализ результатов проводили с помощью программы Sigma-Plot 9.0 ("Systat Software Inc.", США).
Кинетику роста бластемы в экспериментальных и контрольных группах животных определяли методом прижизненной компьютерной морфометрии, который основан на регистрации фотоконтраста между старыми (пигментированными) и новыми (прозрачными) частями тела планарий (Тирас и др., 1996). Регенерирующих планарий фотографировали под бинокулярной лупой через 72 ч после ампутации. На полученных изображениях определяли площадь всей планарии (S) и площадь прозрачной регенерирующей бластемы (s). Скорость регенерации планарий характеризовали индексом регенерации R = s/S. Величину биоэффекта оценивали как относительную разницу R между средними значениями индекса регенерации для контрольных и опытных групп, выраженную в процентах. Каждое из определяемых значений R - результат усреднения измерений по 30 животным как в опыте, так и в контроле. Ошибка в определении R не превышала 3%.
В качестве дополнительного критерия оценки роста бластемы использовали определение митоти-ческой активности необластов в постбластеме (в ткани, непосредственно примыкающей к бластеме) путем остановки деления метафазных клеток. Сразу после ампутации у планарий головной или хвостовой частей в среду с животными добавляли колхицин в концентрации 0.05%. Через 24 ч участки постбластемы ампутировали и помещали для диссоциации в раствор, содержащий смесь ледяной уксусной кислоты, 96% этилового спирта, глицерина и воды в соотношении объемов 1 : 3 : 2 : 14. Для выявления метафазных фигур использовали флуоресцентный краситель Hoechst-33342 ("Sigma", США) в концентрации 1 мкг/мл. На полученных препаратах клеток с помощью микроскопа ЛЮМаМ-2 ("ЛОМО", Россия) определяли число метафазных фигур на 1000 клеток (митотический индекс, MI). Величину биоэффекта оценивали как относительную разницу AMI между средними значениями ми-
0 -5 -10 -15 -20 -25 -30 -35
х10-4 1.4
J_I_I_I_I_L_
10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10
10
1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2
0
1 2 Ш
1 2
rt-
10"
10
,-6
Влияние мелатонина на рост головной (а) и хвостовой (б) бластем планарий G. tigrina. 1 - контроль, 2 - опыт,
* отличия достоверны при р < 0.001. По оси абсцисс - концентрация мелатонина, М. По оси ординат: а - величина эффекта AR, % (AR =
(Rù - RK)±(mù - тк) х 100% Ap - х 100%, где AR - разница меж-
RK
ду средними величинами индекса регенерации в экспериментальных (Rù) и контрольных (RK) образцах; тэ К - ошибки среднего для измерений в опыте и контроле); б - индекс регенерации R = s/S, отн. ед. (см. в тексте).
тотического индекса для контрольных и опытных групп, выраженную в процентах. Каждое экспериментально полученное значение М1 является результатом усреднения по 30000 клеток.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В ходе исследования обнаружено, что мелатонин вызывает ингибирование роста головной бластемы планарий О. tigrina. На рисунке приведена концентрационная зависимость влияния изучаемого гормона на регенерацию головы этих животных. Максимальный эффект, равный -25% ± 6%, наблюдали при концентрации мелатонина 10-4 М. При концентрации мелатонина 10-5 М происходит достоверное снижение вызываемого эффекта до
а
468
ЕРМАКОВА и др.
Влияние мелатонина на митотическую активность необластов в головной и хвостовой постбластемах планарий G. tigrina
Концентрация мелатонина, M Mитотический индекс MI ± m Биологический эффект AMI ± mAMI**, %
контроль опыт
Головная постбластема
10-4 0.0261 ± 0.0004 0.0133 ± 0.0002 -49% ± 2.3%*
10-6 0.0243 ± 0.0003 0.0170 ± 0.0003 -30% ± 2.5%*
Хвостовая постбластема
10-4 0.0122 ± 0.0002 0.0125 ± 0.0001 2.4% ± 2.5%
10-6 0.0133 ± 0.0003 0.0136 ± 0.0004 2.3% ± 5.2%
(MI3 - MIK) ± (тэ - mK)
Примечания: * различия достоверны прир < 0.001; ** AMI =-—-х 100%, где М1э и MIK - средняя величина
MIK
митотического индекса в экспериментальных и контрольных образцах соответственно, mK э - ошибки среднего для измерений.
AR = -19 ± 6%, а при концентрации 10 7 M - AR = = -12 ± 5.5%. Уменьшение содержания мелатонина в растворе с регенерирующими планариями до 10-8 M вызывало достоверное усиление эффекта ингибирования роста бластемы до -24 ± 5.4%. Дальнейшее снижение концентрации изучаемого гормона приводило к снижению уровня ингибирования роста головной бластемы планарий: при концентрации 10-9 M AR составляло -21 ± 6%, а при концентрации 10-10 M было равно -12 ± 5.9%.
Таким образом, эффективность ингибирования мелатонином регенерации головы у планарий G. tigrina сопровождалась наличием двух концентрационных максимумов биологического эффекта, вероятно, связанного с особенностями физиологической активности изучаемого гормона в организме планарий. Возможно, это обусловлено наличием у этих животных разных мелатониновых рецепторов, имеющих различные константы связывания с лигандом и соответственно проявляющих максимальную активность при разных концентрациях ме-латонина.
Одновременно с исследованием влияния мелатонина на регенерацию головы у планарий мы провели анализ митотической активности необластов в головной постбластеме. Приведенные результаты (таблица) показывают, что добавление в среду мелатонина в концентрации 10-6 M сопровождалось достоверным снижением уровня пролиферации необластов на 50 ± 3%. Они также указ
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.