НЕЙРОХИМИЯ, 2015, том 32, № 2, с. 169-174
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ^^^^^^^^^^^^ РАБОТЫ
УДК 573.7
ВЛИЯНИЕ МИКРОИНЪЕКЦИЙ ГЛИЦИНА В МЕДИАЛЬНУЮ ПРЕОПТИЧЕСКУЮ ОБЛАСТЬ ГИПОТАЛАМУСА НА ПАРАМЕТРЫ ПОЛОВОГО ПОВЕДЕНИЯ САМЦОВ КРЫС
© 2015 г. З. Д. Журавлева1, *, А. В. Лебедева1, А. Б. Вольнова2, И. В. Мухина1, 3, М. Я. Друзин4
Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского, Россия 2Санкт-Петербургский государственный университет, Россия 3Нижегородская государственная медицинская академия, Россия 4Университет Умео, г. Умео, Швеция
Механизмы, лежащие в основе преждевременной потери мужчинами репродуктивной функции, остаются неясными. В связи с этим изучение данной проблемы является актуальной научной задачей. Медиальное преоптическое ядро является важным звеном в цепи регуляции полового поведения, однако роль его глицинергической системы все еще не исследована. Изучению вышеназванных вопросов посвящена данная статья.
Ключевые слова: медиальное преоптическое ядро, гипоталамус, глицин, половое поведение.
Б01: 10.7868/81027813315020120
ВВЕДЕНИЕ
Изучению физиологических механизмов репродуктивной функции и полового поведения позвоночных посвящено множество работ. К настоящему моменту накоплен большой объем данных по нервной и гуморальной регуляции репродуктивной функции [1, 2]. Вместе с тем, многие вопросы репродуктивной физиологии животных и человека по-прежнему остаются малоизученными.
Половое поведение самцов млекопитающих — сложный комплекс поведенческих реакций, вызванных, направленных и поддерживаемых внешними и внутренними сигналами. Важную роль в регуляции полового поведения у самцов играет медиальная преоптическая область (МПО) гипоталамуса. Многочисленные исследования, проведенные как на биохимическом, так и на поведенческом уровне, показывают [3], что МПО, вероятно, играет ведущую роль в регуляции полового поведения самцов. Есть данные литературы о том, что нейроны в этом ядре, получающие сенсорную и эндокринную информацию, предположительно, интегрируют ее с информацией о совершаемых поведенческих паттернах, чтобы всесторонне регулировать сложный комплекс полового поведения. Наблюдаемый уже в период эмбрионального развития половой диморфизм этих образований гипоталамуса у крыс связывают с регуляцией МПО полового поведения именно
* Адресат для корреспонденции: 603950, Нижний Новгород, просп. Гагарина, д. 23, корп. 7, e-mail: zhuravlyova@neuro.nnov.ru.
самцов. Результаты исследований также показывают, что при разрушении МПО в модельных экспериментах сексуальное поведение крыс-самцов угнетается, а при стимуляции МПО — активируется [1].
Ряд нейротрансмиттеров, представленных в этом образовании, по-видимому, играет важную роль в механизмах нейрональной пластичности, что показано на переживающих срезах МПО самцов крыс и, вероятно, участвует в регуляции поведенческих актов [4, 5]. В настоящее время проводятся многочисленные исследования роли глутаматергической, ГАМКергической, серото-нинергической и дофаминергической систем в регуляции полового поведения, и, в частности, их роли в МПО [4].
Результаты экспериментов, проведенных на срезах мозга крыс-самцов, содержащих МПО, показали, что быстрые тормозные реакции в нейронах МПО происходят за счет ГАМК и глицина [5]. Глицин, как и ГАМК, является по преимуществу тормозным нейромедиатором, однако, в настоящее время хорошо известна его роль в качестве ко-агониста ММЭА-рецептора глутамата [6]. Таким образом, глицин может являться посредником, как тормозной, так и возбуждающей ней-ропередачи в зрелой ЦНС. Несмотря на значительное число глицин-иммунореактивных волокон, присутствующих в МПО и на то, что глициновые аппликации на изолированные нейроны переживающих срезов МПО порождают стрихнин-чувствительные токи [7], не существует
прямых доказательств участия этого типа рецепторов в синаптической передаче в МПО. Таким образом, роль глицинергической системы в регуляции функций МПО изучена недостаточно.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Для изучения роли глицинергической системы МПО в нейрональной регуляции полового поведения самцов крыс был использован комплексный методический подход, включающий исследования как на клеточном (исследование срезов мозга методом patch-clamp), так и на поведенческом уровнях (изучение влияния микроинъекций веществ в МПО на параметры полового поведения). Часть экспериментов на начальном этапе работы с хроническими животными была выполнена в лаборатории физиологии клетки кафедры общей физиологии биолого-почвенного факультета СПбГУ, на базе вивария СПбГУ. Часть экспериментов, включая работу с диссоциированными нейронами и дальнейшие опыты на хронических животных, была выполнена в лаборатории изучения ионных каналов и нейронального сигналинга Университета Умео, Швеция, на базе вивария Университета Умео. Все экспериментальные и хирургические процедуры были одобрены этической комиссией Университета Умео и были проведены в соответствии с "Правилами проведения работы с использованием экспериментальных животных за № 755 от 12.08.1977" и "Правилами лабораторной практики в Российской федерации, утвержденными приказом Министерства здравоохранения РФ № 267 от 19.06.2003".
Приготовление препаратов диссоциированных клеток. Эксперименты проводились на изолированных нейронах, диссоциированных из срезов, приготовленных из МПО. Для приготовления диссоциированных нейронов использовались самцы крыс линии Sprague-Dawley массой 60— 100 г. Животные декапитировались с помощью гильотины без использования анестезии. Мозг извлекался и помещался в ледяной инкубационный раствор на 5—10 мин. Затем из мозга вырезался блок ткани, содержащий медиальное пре-оптическое ядро, после чего он нарезался на фронтальные срезы толщиной 300 нм на вибротоме (752 M, Campden Instruments, Leicestershire, UK). Срезы инкубировались в инкубационном растворе при температуре 29—31°C не менее 1 ч до начала диссоциации. Механическая вибродиссоциация проводилась неферментативно, с использованием стеклянного стержня (0.5 мм диаметром), закрепленного на пьезоэлектрическом биморфном кристалле и направленного на медиальное преоптическое ядро. Диссоциированные клетки осаждались на дно чашки Петри в течение 10 мин, после чего чашка Петри помещалась в ре-
гистрационную камеру электрофизиологической установки.
Электрофизиологическая регистрация активности нейронов. Для регистрации использовалась конфигурация whole cell patch-clamp, модификация perforated-patch с использованием антибиотика амфотерицина Б в качестве агента для перфорации клеточной мембраны. Все токи записывались в режиме voltage clamp. В качестве регистрирующих электродов использовались бо-росиликатные пипетки (GC150, Clark Electromedical Instruments, Pangbourne, UK), заполненные внутриклеточным раствором и погруженные во внеклеточный раствор и имеющие сопротивление 2—7 мОм. Сигнал записывался с использованием усилителя Axopatch 200A, интерфейса Digidata 1200 и программного обеспечения pClamp (Axon Instruments, Foster City, CA), под контролем персонального компьютера. Записанный сигнал фильтровался низкочастотным фильтром на частоте 2—10 кГц (23 дБ).
Все растворы, как для продолжительной перфузии, так и для кратковременной аппликации, поступали с помощью самотечной скоростной перфузионной системы, контролируемой с помощью соленоидных валов, в свою очередь контролирующихся с помощью компьютера. Все эксперименты проводились при комнатной температуре (23—25°C). Все процедуры и манипуляции по поиску нейронов и регистрации параметров методом perforated-patch осуществляли под оптическим контролем с помощью инвертированного микроскопа с дифференциальным контрастом по Номарскому (увеличение х20).
Схема эксперимента. Для проведения электрофизиологических экспериментов с диссоциированными нейронами, осажденными на дно чашки Петри, совершались следующие манипуляции: под контролем микроскопа выбирали нейрон, затем к нему подводилась перфузионная пипетка, и с помощью микроманипуляторов совершалось присоединение регистрирующего электрода к нейрону. Далее выдерживали интервал в 10—15 мин, чтобы амфотерицин, содержащийся в кончике регистрирующей пипетки, проделал достаточно перфораций в клеточной мембране. После этого совершалась регистрация параметров по следующей схеме.
В течение одного эксперимента на клетку 8 раз (с интервалом в 1 мин) апплицировался 1 мМ раствор ГАМК, затем 5 раз апплицировался раствор, содержащий одновременно 1 мМ р-р ГАМК и р-р стрихнина в заданной концентрации, затем вновь 8 раз апплицировался раствор, содержащий только 1 мМ ГАМК (рис. 1—3). Длительность каждой аппликации — 200 мс. В качестве промывающего раствора использовался внеклеточный раствор. Регистрация проводилась в конфигурации whole
ВЛИЯНИЕ МИКРОИНЪЕКЦИЙ ГЛИЦИНА
171
Подсадка
самца Латентный период маунтинга
Длительность периода покоя
1-я сессия
2-я сессия
Щ
\
подсадка самки
MMMM
M I Mil MM I I
-длите
льность сессии _ ** -
MMM I I M I Ml MM I I
E MM t, мин
длительность сессии
* латентный период интромиссии ** латентный период эякуляции Рис. 1. Схема выделения регистрируемых в экспериментах паттернов полового поведения самцов крыс.
cell patch-clamp, модификация perforated-patch. Регистрировали следующие параметры токового ответа нейрона: 1) амплитуду пика непосредственного токового ответа на аппликацию веществ и 2) амплитуду остаточного тока токового ответа на аппликацию веществ.
Данные, полученные на пяти нейронах, обрабатывались с использованием программы Origin software 4.0.
Регистрация параметров полового поведения животных. Для исследования роли МПО и исследуемых веществ в регуляции полового поведения самцов крыс в условиях хронического эксперимента, нами была предпринята регистрация параметров полового поведения у интактных самцов, а также у животных после билатеральных микроинъекций веществ в МПО.
Всего в экспериментах участвовали 11 самок и 19 самцов. Из них 6 самок и 16 самцов линии Sprague Dawley массой от 350 до 450 г в возрасте от трех до шести месяцев, содержавшихся на базе вивария Университета Умео и 5 самок и 3 самца линии Wistar в во
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.