научная статья по теме ВЛИЯНИЕ МИКРООКРУЖЕНИЯ НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ В-ЛИМФОЦИТОВ МЫШИ Биология

Текст научной статьи на тему «ВЛИЯНИЕ МИКРООКРУЖЕНИЯ НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ В-ЛИМФОЦИТОВ МЫШИ»

БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2008, том 25, № 5, с. 360-366

УДК 577.352

ВЛИЯНИЕ МИКРООКРУЖЕНИЯ НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ В-ЛИМФОЦИТОВ МЫШИ

© 2008 г. И. Н. Дьяков*, М. В. Гаврилова, И. Н. Чернышева, Е. В. Сидорова

ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова, 105064 Москва, пер. Малый Казённый, д. 5а; тел.: (495) 674-08-42; факс: (495) 674-57-10; *электронная почта: dyakov.ilya@gmail.com

Поступила в редакцию 02.06.2008 г.

В отличие от спленоцитов клетки перитонеальной полости мышей не секретируют иммуноглобулины (ИГ). Уже через сутки после внутрибрюшинного введения спленоцитов, содержащих ИГ-образу-ющие клетки (ИГОК), число ИГОК в брюшной полости мышей резко снижается. Это снижение не связано с "уходом" введенных клеток в селезенку, так как спленэктомия на этот процесс не влияет. Для проверки предположения о том, что отсутствие ИГОК в брюшной полости обусловлено угнетением синтеза/секреции ИГ, мышам внутрибрюшинно вводили перитонеальные клетки, которые предварительно инкубировали in vitro (содержали 4360 ИГ0К/106 клеток). Через сутки в перитонеальной полости мышей-реципиентов выявлялось около 30% от числа перенесенных ИГОК, однако на 4-е сутки выявить ИГОК уже не удавалось. Повторная инкубация клеток брюшной полости реципиентов in vitro приводила к появлению ИГОК. Полученные данные свидетельствуют о том, что пери-тонеальное микроокружение угнетает функциональную активность В-лимфоцитов.

В настоящее время В-лимфоциты подразделяют на четыре субпопуляции, различающиеся локализацией, фенотипическими характеристиками и функциональными свойствами: В-1а, В-lb, В-2 и В-клетки маргинальной зоны селезенки (MZ-B) [1]. Эти субпопуляции в разных органах представлены по-разному: в селезенке преимущественно В-2-клетками, а в перитонеальной полости - В-1. Довольно долго считалось, что клетки, принадлежащие к одному пулу, одинаковы, поэтому при изучении лимфоцитов В-1 и В-2 в качестве "эталонных" использовали В-1-клетки перитонеальной полости и В-2-клетки селезенки соответственно. Однако в последнее время получены данные, которые указывают на существование различий между В-лимфоцитами, принадлежащими к одной субпопуляции, но имеющими разную локализацию [2-5]. Так, В-1- и В-2-клетки селезенки мыши синтезируют и секретируют иммуноглобулины (ИГ) в отличие от В-лимфоцитов перитонеальной полости. В то же время при адоптивном переносе конгенным реципиентам или при культивировании in vitro такие клетки начинают спонтанно сек-ретировать IgM [4-7]. Это свидетельствует о влиянии микроокружения на функциональную активность В-клеток.

В настоящей работе исследовали влияние пери-тонеального микроокружения на продукцию ИГ В-лимфоцитами мыши. В качестве экспериментальной модели использовали адоптивный перенос нормальных и культивированных in vitro спленоцитов и перитонеальных клеток мышей СВА в

* Автор для переписки.

брюшную полость нормальных и спленэктомиро-ванных мышей CBA/N. О функциональной активности переносимых В-клеток судили, определяя методом ELISPOT число IgM-продуцентов. Полученные данные свидетельствуют о том, что пери-тонеальное микроокружение угнетает образование ИГ В-лимфоцитами мыши.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Животные. В опытах использовали нормальных самок мышей СВА массой 16--18 г, полученных из питомника "Андреевка" (Москва, Россия), и нормальных и спленэктомированных мышей CBA/N. Xid-мыши любезно предоставлены сотрудниками вивария ЦНИИ туберкулеза и размножены в виварии НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова.

Спленэктомия. Спленэктомию самок мышей CBA/N проводили с использованием для ингаляционной анестезии диэтилового эфира, а в качестве шовного материала POLYSORB UL-204 (3-0) и по-лигликолида PGA (3/0). Мышей фиксировали на препаративном столике, разрезали кожу и вскрывали брюшную полость. Селезенку удаляли, предварительно наложив лигатуру на сосуды. После спленэктомии поэтапно закрывали перитонеаль-ную полость и кожу. Для профилактики послеоперационных инфекций применяли сульфаниламид и спиртовой раствор бриллиантового зеленого. В опытах использовали животных спустя 4-6 недель после операции.

Получение клеточным суспензий и адоптивный перенос. Моноклеточную суспензию сплено-

Содержание В-лимфоцитов, Т-лимфоцитов и иммуноглобулинобразующих клеток в перитонеальной полости нормальных и спленэктомированных мышей CBA/N после внутрибрюшинного введения им спленоцитов CBA*

Лимфоциты Нормальные мыши CBA/N Спленэктомированные мыши CBA/N

норма через 1 сут через 4 сут норма через 1 сут через 4 сут

CD19 + В-лимфоциты, % 5.41 10.32 12.63 3.055 10.97 13.36

CD3 + Т-лимфоциты, % 18.52 35 27.3 27.6 35.63 18.7

Число ИГОК в брюшной 0 340 150 0 220 100

полости реципиентов

* Введенные клетки содержали 17500 ИГОК.

цитов получали, гомогенизируя селезенку в среде RPMI 1640. Эритроциты удаляли осмотическим шоком. Перитонеальные клетки получали, вымывая содержимое брюшной полости средой RPMI 1640 (10 мл). Клетки отмывали средой и подсчитывали их число в камере Горяева. При адоптивном переносе мышам CBA/N внутрибрюшинно вводили по 5 х 106 спленоцитов или по 1.5-2 х 106 клеток перитонеальной полости мышей СВА в 200 мкл среды. Клетки из брюшной полости CBA/N реципиентов выделяли через сутки или через 4 суток после переноса. В качестве контроля использовали перитонеальные клетки интактных мышей СВА и CBA/N.

Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток. Фенотипические характеристики клеток изучали с помощью цитофлуориметрии [8]. Для выявления поверхностных маркеров использовали конъюгаты: PE anti-mouse CD19 (1D3) ("BD Pharm-ingen") и FITC anti-mouse CD3 molecular complex (17A2) ("BD Pharmingen"). Окрашенные клетки разделяли на проточном цитофлуориметре EPICS XL ("Beckman Coulter", США). Результаты обрабатывали с помощью программы SYSTEM II (Beck-man Coulter).

Культивирование клеток. Клетки мышей CBA или CBA/N культивировали в 96-луночных плашках ("Nunc", Дания) в 200 мкл полной среды (RPMI-1640 с 10% фетальной бычьей сыворотки ("Gibco", США) и всеми необходимыми добавками) в СО2-инкубаторе при +37°С в течение 4 дней. В лунки вносили по 1 х 106 клеток селезенки или по 0.8 х 106 перитонеальных клеток. По окончании инкубации клетки собирали, отмывали, определяли число ИГОК с помощью ELISPOT и вводили внутрибрюшинно мышам CBA/N.

Клеточный иммуноферментный анализ (ELISPOT). Для выявления IgM-ИГОК использовали нитроцеллюлозные планшеты ("Millipore"), которые сенсибилизировали козьими антителами к ИГ мыши ("Sigma", США). На сенсибилизированные и отмытые фосфатно-солевым буфером нитроцеллюлозные диски наносили по 10 х 103 клеток селезенки или брюшной полости мышей и культивировали их при температуре 37°С в среде

ИРМЫ 640 с 1% фетальной бычьей сыворотки ("вШсо", США) в течение 18-24 ч в С02-инкубато-ре. После инкубации клетки удаляли, диски отмывали, добавляли усиливающую кроличью антисыворотку к 1§М мыши, конъюгат пероксидазы с антителами к кролика, и субстратный буфер, содержащий 1,4-хлорнафтол и Н202. Реакцию останавливали дистиллированной водой, фильтры высушивали, подсчитывали число окрашенных комплексов (плаков) под микроскопом и пересчитывали на 106 клеток.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Выявление ИГОК в перитонеальной полости мышей CBA/N после внутрибрюшинного введения спленоцитов СВА. Ранее мы показали, что уже через 1 сут после внутрибрюшинного введения спленоцитов СВА мышам СВА^ в брюшной полости реципиентов остается лишь незначительная часть ИГОК (не более 1.5% перенесенных), хотя при этом ~50% клеток представлено перенесенными спленоцитами [7]. Это могло объясняться тем, что большинство В-клеток (в том числе ИГОК) покидает брюшную полость ("хоминг"). В связи с этим было решено выяснить, повлияет ли удаление селезенки на число ИГОК в брюшной полости мышей СВА/^ которым внутрибрюшинно ввели функционирующие спленоциты мышей СВА.

Спленэктомированным и интактным мышам СВА^ внутрибрюшинно вводили по 5 х 106 спленоцитов СВА, содержащих 3500 ИГОК/106 клеток, т.е. по 17500 ИГОК на мышь. В переносимых спле-ноцитах клетки СБ19+ (В-лимфоциты) составляли 37.8%, а СБ3+-клетки (Т-лимфоциты) - 24.4%. Суммарное число клеток, число ИГОК, а также В-и Т-лимфоцитов в брюшной полости мышей-реципиентов определяли через сутки или через 4 суток после переноса. В брюшной полости мышей СВА^ до введения им клеток СВА содержалось 0.7 х 106 клеток, ИГОК при этом отсутствовали. В перитонеальной полости нормальных мышей СВА/^ через 1 сут после переноса выявляли 3.3 х 106 клеток, в том числе 340 ИГОК (т.е. 1.95% от числа введен-

Число ИГОК в брюшной полости 50000 45000 40000 35000 30000 25000 20000 15000 10000 5000 0

14

Сутки после переноса

Рис. 1. Изменение числа иммуноглобулин-образующих клеток в брюшной полости мышей CBA/N, получивших клетки селезенки или брюшной полости мышей CBA. • - Интактные спленоциты СВА; ▲ - пери-тонеальные клетки СВА; ■ - спленоциты СВА, инкубированные in vitro

ных ИГОК), а через 4 сут - 2.5 х 106 клеток, среди которых было 150 ИГОК (0.9% от числа введенных ИГОК). В брюшной полости спленэктомиро-ванных мышей через 1 сут после переноса было 3.4 х 106 клеток, в том числе 220 ИГОК (т.е. 1.26% от числа введенных ИГОК), а через 4 сут - 2.5 х 106 клеток, содержащих 100 ИГОК (0.6% от числа введенных ИГОК). С использованием иммунофлуо-ресцентного окрашивания клеток брюшной полости реципиентов показано, что содержание CD19+ В-лимфоцитов у нормальных и спленэктомиро-ванных мышей было одинаковым и значительно большим, чем у мышей CBA/N до введения им клеток CBA. Содержание CD3+-клеток через сутки у реципиентов также было одинаковым, однако на 4-е сутки в брюшной полости спленэктомирован-ных мышей CBA/N удавалось выявить несколько меньше Т-клеток, чем у нормальных мышей (таблица). Таким образом, отсутствие селезенки не повлияло на содержание ИГОК в перитонеальной полости мышей СВА/N, которым внутрибрюшин-но ввели спленоциты СВА.

Выявление ИГОК в брюшной полости мышей CBA/N после внутрибрюшинного введения им инкубированных in vitro спленоцитов и перитоне-альныи клеток мышей СВА. Из приведенных выше данных видно, что перенесенные в брюшную поло

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком