научная статья по теме ВЛИЯНИЕ МОДИФИКАЦИИ NO-СТАТУСА, ЗАКАЛИВАЮЩЕГО ПРОГРЕВА И ПЕРОКСИДА ВОДОРОДА НА АКТИВНОСТЬ АНТИОКСИДАНТНЫХ ФЕРМЕНТОВ В ПРОРОСТКАХ ПШЕНИЦЫ Биология

Текст научной статьи на тему «ВЛИЯНИЕ МОДИФИКАЦИИ NO-СТАТУСА, ЗАКАЛИВАЮЩЕГО ПРОГРЕВА И ПЕРОКСИДА ВОДОРОДА НА АКТИВНОСТЬ АНТИОКСИДАНТНЫХ ФЕРМЕНТОВ В ПРОРОСТКАХ ПШЕНИЦЫ»

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2015, том 62, № 3, с. 317-323

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ^^^^^^^^^^^^ СТАТЬИ

УДК 581.1

ВЛИЯНИЕ МОДИФИКАЦИИ NO-СТАТУСА, ЗАКАЛИВАЮЩЕГО ПРОГРЕВА И ПЕРОКСИДА ВОДОРОДА НА АКТИВНОСТЬ АНТИОКСИДАНТНЫХ ФЕРМЕНТОВ В ПРОРОСТКАХ ПШЕНИЦЫ © 2015 г. Ю. В. Карпец, Ю. Е. Колупаев, Т. О. Ястреб, А. И. Обозный

Харьковский национальный аграрный университет им. В.В. Докучаева, Харьков, Украина

Поступила в редакцию 08.09.2014 г.

Для выяснения роли оксида азота (NO) как возможного посредника в процессах индуцирования ан-тиоксидантной системы исследовали влияние скавенджера оксида азота - 100 мкМ PTIO (2-phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide); ингибитора фермента, подобного NO-синтазе животных, — 2 мМ L-NAME (NG-nitro-L-arginine methyl ester); донора NO - 2 мМ НПН (нитропрус-сида натрия); одноминутного закаливающего прогрева при температуре 42°С и обработки 10 мМ пероксидом водорода на активность антиоксидантных ферментов в корнях этиолированных проростков пшеницы (Triticum aestivum L.). Под действием PTIO и L-NAME происходило повышение активности супероксиддисмутазы (СОД), каталазы и гваяколпероксидазы. Такой же эффект вызывали обработка НПН и закаливающий прогрев; под влиянием пероксида водорода происходило увеличение активности СОД и каталазы. Предобработка интактных корней проростков PTIO и L-NAME существенно не изменяла характер влияния закаливания и пероксида водорода на активность изученных ферментов. Сделано заключение, что как увеличение, так и снижение содержания NO в клетках может индуцировать ферментативную антиоксидантную систему.

Ключевые слова: ТгШеиш ае.^иш — антиоксидантные ферменты — оксид азота (N0) — пероксид водорода — тепловое закаливание — теплоустойчивость

DOI: 10.7868/S0015330315030094

ВВЕДЕНИЕ

За последние годы накоплено немало сведений об участии оксида азота (NO) в адаптации растений к действию абиотических стрессоров [1—3], в том числе к гипертермии [4—6]. Показано повышение содержания NO в клетках растений как при продолжительном действии закаливающей температуры [5], так и после кратковременного действия гипертермии [6]. Установлено, что обработка растений скавенджером оксида азота PTIO (2-phenyl-4,4, 5, 5 -tetramethylimidazoline-1 -oxyl-3-oxide) препятствовала формированию их индуцированной теплоустойчивости [5, 6]. С другой стороны, под действием экзогенного NO происходило повышение устойчивости растений к гипертермии [7, 8].

Сокращения: БТШ — белки теплового шока; НПН — донор NO (нитропруссид натрия); СОД — супероксиддисмутаза; L-NAME — ингибитор NO-синтазы (NG-nitro-L-arginine methyl ester); PTIO — скавенджер NO (2-phenyl-4,4,5,5-tet-ramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide).

Адрес для корреспонденции: Колупаев Юрий Евгеньевич. Украина, 62483 Харьков, п/о "Коммунист-1". Харьковский национальный аграрный университет им. В.В. Докучаева. Электронная почта: plant_biology@mail.ru

Есть основания полагать, что в растительных клетках между оксидом азота и пероксидом водорода, являющимися сигнальными посредниками во внутриклеточных процессах, происходит тесное функциональное взаимодействие. Так, при обработке суспензионной культуры Hypericum perforatum и проростков пшеницы экзогенным H2O2 увеличивалось содержание в клетках оксида азота, а под влиянием донора NO происходило повышение количества эндогенного H2O2 [6, 9]. При этом оба воздействия индуцировали развитие теплоустойчивости. Обработка проростков пшеницы антиоксидантами препятствовала вызываемому закаливающим прогревом повышению содержания оксида азота в корнях, а обработка PTIO или ингибитором фермента, подобного NO-синтазе животных, L-NAME (NG-nitro-L-arginine methyl ester) нивелировала повышение содержания пероксида водорода, вызываемое действием на проростки закаливающей температуры [6].

Одной из защитных реакций растений, важных для развития теплоустойчивости, является активация системы антиоксидантной защиты. Показано, что повышение теплоустойчивости

проростков пшеницы под влиянием закаливающего прогрева [10] и экзогенного Н202 [11] сопровождалось увеличением активности антиоксидантных ферментов, в частности супероксиддис-мутазы (СОД) и каталазы.

В связи с имеющимися данными о повышении содержания эндогенного оксида азота в клетках растений при тепловом закаливании растений и действии пероксида водорода [6, 9] логично предположить, что модификация М0-статуса растений может отразиться на формировании защитных реакций, индуцируемых закаливанием и экзогенным Н202, в частности, на функционировании системы антиоксидантной защиты. Представлялось, что обработка растительных объектов скавендже-ром N0 или ингибитором фермента, подобного МО-синтазе животных, должна препятствовать повышению активности антиоксидантных ферментов, вызываемому действием на растения закаливающей температуры и пероксида водорода, и наоборот воздействие донора N0 должно активировать антиоксидантную систему. Экспериментальная проверка этой рабочей гипотезы на примере интактных корней проростков пшеницы показала, что изменение МО-статуса растительных клеток влечет за собой ответные реакции антиок-сидантной системы, которые не укладываются в простую схему.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования служили этиолированные проростки мягкой озимой пшеницы (ТгШеыш агзИуыт Ь.) сорта Элегия, выращенные на очищенной водопроводной воде при температуре 22°С. Корни интактных этиолированных проростков в течение 24 ч выдерживали в растворах 100 мкМ РТ10 или 2 мМ Ь-МАМЕ. Концентрации этих соединений, снижающие положительное влияние закаливающего прогрева на теплоустойчивость проростков, но не оказывающие значительного негативного влияния на базовую теплоустойчивость, были выбраны на основании предварительных опытов [6]. Контрольные проростки инкубировали на воде.

После обработки исследуемыми соединениями часть проростков, помещенных в марлевые мешочки, подвергали одноминутному закаливающему прогреву при температуре 42.0 ± 0.1°С в водяном ультратермостате [10]. Затем растительный материал снова переносили на растворы исследуемых соединений и выдерживали на них 24 ч до момента тестирующего (потенциально летального) прогрева. Контрольные проростки все это время инкубировали на воде.

Как было установлено ранее, наиболее существенное повышение активности антиоксидант-ных ферментов в корнях проростков пшеницы

происходило через 6—24 ч после закаливающего прогрева [10]. В связи с этим через такие временные отрезки отбирали пробы корней для анализа активности СОД, каталазы и гваяколпероксида-зы. Кроме того, активность этих ферментов определяли через 24 ч после повреждающего прогрева. Ранее было показано, что через сутки после повреждающего прогрева видимые повреждения проростков не проявлялись, но в то же время отмечали существенные отличия в активности ферментов у контрольных и закаленных кратковременным прогревом проростков [10].

В отдельных сериях экспериментов исследовали влияние на активность антиоксидантных ферментов Н202 (10 мМ) и донора N0 нитропруссида натрия (НПН, 2 мМ). В этом случае корни ин-тактных проростков инкубировали в растворах в течение 24 ч, после чего проростки подвергали повреждающему прогреву, как описано выше. Рабочие концентрации этих соединений, вызывающие наиболее существенное повышение теплоустойчивости, были выбраны в предварительных экспериментах. При изучении комбинированного действия Н202 с РТ10 или Ь-МАМЕ обработку корней скавенджером М0 или ингибитором фермента начинали за 24 ч до начала обработки пе-роксидом водорода.

При изучении влияния РТ10 или Ь-МАМЕ на проявление вызываемой пероксидом водорода индукции теплоустойчивости проростки, обработанные указанными соединениями, подвергали повреждающему прогреву в водяном ультратермостате при температуре 46.0 ± 0.1°С в течение 10 мин. Через 4 суток после воздействия повреждающего прогрева оценивали количество выживших проростков [10].

Для биохимических экспериментов использовали корни интактных проростков, которые чувствительны к воздействию гипертермии и удобны при проведении ингибиторного анализа [6, 10]. Активность антиоксидантных ферментов определяли по методикам, подробно описанным ранее [8, 10], с некоторыми модификациями. Навески корней гомогенизировали при температуре 2—4°С в 0.15 М К,№-фосфатном буфере (рН 7.6) с добавлением ЭДТА (0.1 мМ) и дитиотрейтола (1 мМ). Для анализа использовали супернатант после центрифугирования гомогената при 8000 g в течение 10 мин при 4°С.

Активность цитозольной СОД (КФ 1.15.1.1), в основном Си^п-СОД [12], определяли при рН реакционной смеси 7.6, используя метод, основанный на способности фермента конкурировать с тетразолием нитросиним за супероксид-анионы, образующиеся вследствие аэробного взаимодействия НАД-Н и феназинметасульфата. Активность каталазы (КФ 1.11.1.6) анализировали при рН реакционной смеси 7.0 по количеству Н202, разло-

Таблица 1. Активность СОД (усл. ед./(мг белка мин)) в корнях проростков пшеницы

Вариант Фаза эксперимента

I II III

Контроль 11.80 ± 0.22 12.42 ± 0.24 12.26 ± 0.27

НПН (2 мМ) 13.06 ± 0.26 15.39 ± 0.19 14.34 ± 0.30

РТЮ (100 мкМ) 13.68 ± 0.27 14.59 ± 0.28 13.64 ± 0.24

Ь-МАМБ (2 мМ) 13.89 ± 0.31 13.91 ± 0.25 13.50 ± 0.23

Закаливание (42°С, 1 мин) 14.31 ± 0.26 15.83 ± 0.21 15.87 ± 0.31

Закаливание (42°С, 1 мин) + РТЮ (100 мкМ) 13.94 ± 0.31 15.78 ± 0.28 15.24 ± 0.23

Закаливание (42°С, 1 мин) + Ь-МАМБ (2 мМ) 13.42 ± 0.28 14.96 ± 0.31 15.70 ± 0.32

Н202 (10 мМ) 12.69 ± 0.33 13.87 ± 0.22 13.76 ± 0.22

Н202 (10 мМ) + РТЮ (100 мкМ) 13.09 ± 0.24 14.57 ± 0.19 14.06 ± 0.28

Н202 (10 мМ) + Ь-МАМБ (2 мМ) 12.32 ± 0.31 13.79 ± 0.21 14.18 ± 0.26

Примечание. I — через 6 ч после начала обработки НПН, H2O2, закаливающего прогрева или через 30 ч воздействия PTIO или L-NAME; II — через 24 ч после начала обработки НПН, H2O2, закаливающего прогрева или через 48 ч воздействия PTIO или L-NAME; III — через 24 ч после повреждающего прогрева.

жившегося за единицу времени. Активность гвая-колпероксидазы (КФ 1.11.1.7) определяли, используя в качестве донора водорода гваякол, а в качестве субстрата — пероксид водорода. С по

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком