ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 51, № 5, с. 490-494
УДК 577.5.579.253.4
ВЛИЯНИЕ МУТАЦИЙ УСТОЙЧИВОСТИ К РИФАМПИЦИНУ НА БИОСИНТЕЗ ЭКЗОПОЛИСАХАРИДОВ ШТАММОМ Escherichia coli K-12 lon © 2015 г. Г. Г. Оганесян, А. А. Барсегян
Научно-производственный центр "Армбиотехнология"Национальной академии наук
Республики Армения, Ереван, 0056
e-mail: hhov@sci.am Поступила в редакцию 04.11.2014 г.
Изучено влияние РНК-полимеразных (rif) мутаций на выход капсулярного экзополисахарида — ко-лановой кислоты (КК) у штамма Escherichia coli K-12 lon. Путем трансдукционного переноса rif-аллелей, обладающих плейотропным действием, было получено 5 изогенных штаммов-продуцентов колановой кислоты. Изогенные штаммы различались удельной скоростью роста, размером и ослиз-нённостью колоний, зависимостью роста от состава питательной среды и температуры культивирования, а также скоростью адсорбции вирулентного бактериофага М59, специфически лизирующего клетки E. coli, продуцирующие КК. Установлена прямая корреляция между выходом экзополисаха-ридов, скоростью роста и адсорбцией бактериофага М59. Среди rf-рекомбинантов отобран штамм АН203, синтезирующий в два раза больше КК при глубинном культивировании по сравнению с родительским штаммом.
Ключевые слова: колановая кислота, экзополисахарид, lon мутация, ^мутации. DOI: 10.7868/S0555109915040133
Большинство микроорганизмов в норме не синтезируют экзополисахариды (ЭПС). Однако в бактериальных клетках присутствует ряд таких генов, как lon, rcs, cps, mdoHи др., мутации в которых приводят к сверхсинтезу ЭПС [1—10]. Такие мутанты легко отличить по характерной для них слизистой морфологии колоний. Под влиянием единичной lon мутации клетки Escherichia coli начинают продуцировать колановую кислоту (КК) — полиуроновый линейный гетерополисахарид, состоящий из D-галактозы, L-фукозы, D-глюкозы, D-глюкуроновой кислоты, ацетата и пирувата, в молярном соотношении 2 : 2 : 1 : 1 : 1 : 1 [11, 12].
В регуляции биосинтеза КК ключевую роль играет lon ген, детерминирующий биосинтез АТФ-за-висимой эндопротеазы (Lon-протеазы). Lon-протеаза регулирует биосинтез КК путем деградации RcsA белка, являющегося позитивным регулятором cps генов, детерминирующих ее биосинтез [7, 13].
Единичная lon мутация приводит к почти 100-кратному увеличению выхода КК по сравнению с диким штаммом [10, 14]. Однако дальнейшее повышение активности у штаммов-продуцентов КК связано с определенными трудностями из-за сложной регуляции ее биосинтеза, осуществляемого при участии более, чем 19 генов [7]. Незначительное повышение активности проду-
центов других ЭПС было достигнуто путем получения устойчивых к грамицидину мутаций, затрагивающих мембранные структуры клетки, ответственные за реакцию поликонденсации активированных нуклеосахаров [15—17].
Для повышения продуктивности штаммов-продуцентов ЭПС можно использовать мутации, влияющие на белоксинтезирующий аппарат клетки, через который реализуется экспрессия генов. Мутации в генах, контролирующих транскрипцию или трансляцию генетической информации, могут вызывать ее разночтение на уровне транскрипции практически любого гена, которое приводит к одновременным изменениям целого ряда свойств бактериальной клетки [18—20]. Так, г1/ (устойчивость к рифампицину) мутации, обладающие плейотропным действием и влияющие на структуру Р-субъединицы РНК-полимеразы, вызывают изменения целого ряда таких свойств бактерий, как морфология колоний, скорость роста, чувствительность к температуре, потребность в факторах роста и др. [17—19]. Ранее, была показана возможность одновременного улучшения технологических, физико-химических и органолептических характеристик молочнокислых бактерий с помощью и/-мутаций. При этом у некоторых из них повышалось содержание экзополисахаридов [21].
Цель работы — увеличить выход экзополисаха-ридов, используя мутации РНК-полимеразы, обладающие плейотропным проявлением у E. coli (lon).
МЕТОДИКА
Бактериальные штаммы и бактериофаги.
Штаммы E. coli K-12: JC335 (F-, leu, his, argG, metE), CA154 (HfrH, thi) были получены из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ). АН200 — lon мутант штамма JC335 получен методом тер мо индукции как описано в работе [22]. Устойчивые к рифампи-цину мутанты получены путем рассева культуры штамма CA154 на среду ТА, содержащую 100 мкг/мл рифампицина.
Трансдуцирующий бактериофаг Plvir получен из ВКПМ. Вирулентный бактериофаг М59, специфически лизирующий продуценты колановой кислоты, получен от С. Стирм [21].
Питательные среды. В качестве питательных сред использовали: полноценную среду Nutrient Broth Standard I, NB ("Serva", Германия), агар триптоза (Tryptose Agar, ТА, "Ferak" Германия) и минимальную среду М9 [23]. В опытах по транс-дукции использовали 0.6%- и 1.5%-ный LB-агар [24]. КК получали выращивая продуцент в среде М9, содержащей 2% глюкозы.
Для биосинтеза экзополисахаридов бактериальные штаммы культивировали в колбах Эрлен-мейера емкостью 500 мл с 50 мл среды М9 в течение 48 ч при 30°C на качалке при скорости вращения 180—200 об./мин.
Выделение и очистка КК. По окончании культивирования культуральную жидкость (КЖ) прогревали на кипящей водяной бане в течение 3 мин для освобождения связанных с клеточной стенкой экзополисахаридов, затем клетки отделяли центрифугированием при 1200 g. Из супернатан-та осаждали КК двумя объемами ацетона. Полученный после центрифугирования осадок растворяли в воде и вновь осаждали двумя объемами ацетона. Осадок ресуспендировали в 1/3 объема воды, диализировали против воды через полупроницаемую мембрану в течение 48 ч при комнатной температуре при перемешивании на магнитной мешалке, меняя воду через 24 ч. После диализа раствор лиофильно высушивали.
Определение динамической вязкости растворов КК. Динамическую вязкость (мПа-с) растворов КК определяли на вискозиметре Хоплера (VEB "Prugerate-Werk Medingen", Германия) [25].
Количество КК определяли по сухой массе после вакуумной сушки водных растворов.
Константу скорости адсорбции и кинетику бактериофага М59 определяли по Адамсу [26].
Для определения скорости роста, исследуемые штаммы выращивали на полноценной среде NB
при 37°С. Биомассу оценивали по величине оптической плотности при 630 нм. Количество жизнеспособных клеток определяли подсчетом колоний, выросших на среде ТА из соответствующих разведений.
Удельную скорость роста культур рассчитывали по методу, описанному в работе [27].
Статистическая обработка полученных результатов. Все эксперименты проводили в 3—5 по-вторностях. Статистический анализ полученных данных осуществляли с использованием метода Стьюдента с критерием достоверностир < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Конструирование изогенных по П/ штаммов — продуцентов КК. Для конструирования изогенных по и/штаммов — продуцентов КК, с помощью бактериофага РЫг была осуществлена котрансдукция п/- аллелей гена гроВ, с тесно сцепленным ше1Е+-маркером в продуцирующий КК штамм АН200. Отбор теЕ+-рекомбинантов штамма АН200 проводили на агаризованной среде М9 без метионина и рифампицина. Среди них г/-котранс-дуктанты были отобраны после пересева методом реплик на среду М9, содержащую 100 мкг/мл ри-фампицина. В результате было отобрано 5 устойчивых к рифампицину изогенных рекомбинантных штаммов — продуцентов КК, обозначенных как АН201 (г/-201), АН202 (и/-202), АН203 (г/-203), АН209 (п/-209) и АН223 (г/-.223), которые различались аллельным состоянием гена гроВ. Эти штаммы сохраняли плейотропный характер действия приобретенных ими и/-аллелей (табл. 1).
Изучение культурально-морфологических и метаболических особенностей и/-рекомбинантов показало, что в зависимости от присутствующего в них и/-аллеля на среде М9 они образовывали колонии различного размера и ослизненности. Максимально крупные колонии образовывали штаммы АН203 и АН223, а мелкие — АН201 и АН202. Штамм АН203 обладал также наиболее высокой удельной скоростью роста как в полноценной, так и в минимальной средах. Однако по сравнению со штаммом АН203 штамм АН223 при выращивании на минимальной среде М9 при пониженной температуре характеризовался меньшей удельной скоростью роста и размерами колоний. Присутствие г1/-201 и г/-202-аллелей в рекомби-нантных штаммах АН201 и АН202 сопровождалось уменьшением удельной скорости роста, размеров колоний и снижением жизнеспособности при культивировании на минимальной среде М9 при низких температурах. Эти данные указывали на плейотропный характер действия изучаемых и/-мутаций.
Выращивание КИ-штаммов проводили при глубинном культивировании в среде М9 в течение
Таблица 1. Сравнительная характеристика Ш^штаммов-продуцентов КК
Штаммы Слизистость колоний на М9 агаре Размер колоний на различных средах и температурах, мм Удельная скорость роста (ц) при 37°С, ч-1
ТА М9
37°С 30 °С 37 °С 30 °С ТА М9
АН200 +++ 3 3 4-5 5-6 1.19 ± 0.15 0.58 ± 0.9
АН201 + 1 1 1 2 0.74 ± 0.11 0.38 ± 0.07
АН202 + 1 1 1 2 0.71 ± 0.10 0.35 ± 0.09
АН203 ++++ 4 4 5-6 7-8 1.44 ± 0.17 0.69 ± 0.11
АН209 +++ 3 3 4-5 2-3 1.10 ± 0.09 0.49 ± 0.07
АН223 ++ 4 3 2 1 1.39 ± 1.20 0.46 ± 0.11
Таблица 2. Биосинтез КК при глубинном культивировании Ш^штаммов
Штамм Содержание бактерий в КЖ, х109 кл./мл Выход КК, мг/мл Вязкость КЖ, мПа • с Вязкость 0.1%-ных растворов КК, мПа • с
АН200 6.1 ± 1.8 7.3 ± 0.34 9.70 ± 0.54 2.22 ± 0.12
АН201 3.9 ± 1.4 4.9 ± 0.28 8.14 ± 0.77 2.23 ± 0.13
АН202 4.2 ± 1.6 4.2 ± 0.31 7.42 ± 0.88 2.19 ± 0.16
АН203 8.2 ± 0,9 12.1 ± 0.43 13.41 ± 0.97 2.18 ± 0. 13
АН209 6.7 ± 1.0 6.6 ± 0.18 9.34 ± 0.59 2.21 ± 0.15
АН223 5.1 ± 1.2 5.1 ± 0.22 8.94 ± 0.95 2.19 ± 0.14
Таблица 3. Адсорбция и относительная эффективность посева бактериофага М59 на штаммах-продуцентах КК
Штамм Относительная эффективность посева фага Размер негативных колоний фага, мм Константа скорости адсорбции фага, х10-9 кл./мл
АН200 1.00 10-12 6.6 ± 0.9
АН201 0.99 7-9 5.4 ± 0.7
АН202 0.97 7-9 4.9 ± 0.8
АН203 1.05 13-15 15.0 ± 1.1
АН209 1.00 8-10 6.4 ± 0.6
АН223 0.97 6-7 2.5 ± 0.3
48 ч. Определение количества образуемой КК указывало на то, что под вл
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.