ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 3, с. 365-372
УДК 581.1
ВЛИЯНИЕ Н202 НА ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ ПО ТИРОЗИНУ БЕЛКОВ ГОРОХА
© 2007 г. Ф. Г. Каримова, Н. В. Петрова
Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской академии наук, Казань Поступила в редакцию 10.05.2006 г.
Выявлено изменение уровня тирозинового фосфорилирования растворимых полипептидов корней гороха (Pisum sativum L.) под действием экзогенной перекиси водорода in situ и in vitro. Идентифицированы полипептиды, уровень фосфорилирования по тирозину которых in situ был ванадат-зави-симым. Тиоловый агент дитиотрейтол и антиоксидант аскорбиновая кислота in vitro обращали эффекты перекиси водорода. Полученные результаты указывают на редокс-регуляцию тирозинового фосфорилирования белков гороха.
Pisum sativum - перекись водорода - редокс-регуляция - фосфорилирование белков по тирозину
ВВЕДЕНИЕ
Все внутриклеточные процессы у многоклеточных организмов находятся под контролем экстраклеточных и внутриклеточных сигналов, определяющих активность различных физиологических процессов для поддержания оптимального гомеостаза, процессов роста, дифференци-ровки и ответных реакций на действие неблагоприятных условий среды. За последние годы показано, что в ответ на разные внешние стимулы генерация активных форм кислорода (АФК) является ключевым компонентом в клеточных реакциях растений, в частности, в феномене "кросс-толерантности" [1, 2]. Согласно данным литературы, содержание АФК в клетках резко возрастает в первые моменты действия неблагоприятных факторов среды. АФК - супероксид
анион (02), перекись водорода (Н202) и гидрок-
сил-радикал (ОН) - являются метаболитами клетки, образующимися при одноэлектронном восстановлении молекулярного кислорода. Наиболее стабильной молекулой среди АФК является Н202. Баланс между АФК и клеточными анти-
Сокращения: АФК - активные формы кислорода, БСА -бычий сывороточный альбумин, ДТТ - дитиотрейтол, ПВДФ-мембраны - поливинилдифторные мембраны, ФМСФ -фенилметилсульфонилфторид, ПП - полипептид, ТБСТ -Трис-буфер солевой с Твином 20, ТЕМЕД - тетраметилэти-лендиамин, ТПК - тирозиновые протеинкиназы, ТПФ - ти-розиновые протеинфосфатазы.
Адрес для корреспонденции: Каримова Фатима Габдуллазя-новна. 420111 Казань, а/я 30. Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН. Факс: 007 (843) 292-73-47; электронная почта: karimova@mail.knc.ru
оксидантными системами определяет внутриклеточный редокс-статус. Работа антиоксидантных систем направлена на уменьшение содержания АФК при помощи супероксиддисмутазы, катала-зы и пероксидаз. Низкомолекулярные антиокси-данты - аскорбиновая кислота, цистеин, мочевая кислота, глутатион и токоферолы - хелатируют редокс-активные металлы и восстанавливают SH-группы ферментов. На сегодняшний день принято, что редокс-сигналы являются ключевыми регуляторами метаболизма, морфологии и развития клеток растений [1, 3].
Показано, что высокая концентрация Н202 ци-тотоксична; в низкой концентрации она функционирует в клетках растений как сигнальная молекула [2, 4]. В низкой дозе Н202 является сигналом для дифференцировки вторичной клеточной стенки [5] и блокирует прохождение фаз клеточного цикла [6]. В листьях, суспензионной культуре клеток и изолированных протопластах АгаЫ-dopsis ^аНапа Н202 запускает каскад митоген-ак-тивируемых протеинкиназ (МАПК), причем активация терминальной МАПК такого каскада происходит в результате фосфорилирования аминокислотных остатков тирозина и треонина [2, 7].
0сновными молекулярными принципами механизма передачи сигналов в клетке являются взаимодействие специфических белков и их фос-форилирование-дефосфорилирование. Найдено, что активность 30% белков эукариот регулируется фосфорилированием-дефосфорилированием [8]. Наибольшая доля белков фосфорилируется по аминокислотным остаткам серина и треонина, тогда как фосфорилирование белков по тирозину составляет незначительную долю от общего содержания фосфобелков [9]. Редокс-регуляция ти-
розиновых протеинфосфатаз (ТПФ) в растениях показана совсем недавно [7]. В растениях обнаружены STY-протеинкиназы, фосфорилирующие белки по остаткам серина, треонина и тирозина, 11-ый домен которых структурно сходен с тиро-зиновыми киназами (ТПК) Src-семейства животных [10]. В клетках позвоночных процессы фос-форилирования-дефосфорилирования белков по остаткам тирозина контролируют процессы пролиферации и дифференцировки [11], а ферменты, катализирующие тирозиновое фосфорилирова-ние-дефосфорилирование, являются редокс-за-висимыми [12, 13].
Выявление взаимосвязи между окислительно-восстановительным (редокс) статусом клеток и системами внутриклеточной сигнализации в настоящее время является одной из актуальных проблем клеточной биологии. В связи с вышеизложенным целью наших исследований было изучение влияния Н202 на уровень тирозинового фосфорилирования белков корней гороха в условиях окисления и восстановления.
МЕТОДИКА
Растения гороха (Pisum sativum L.) выращивали в течение 7 дней на 0.25 нормы питательной среды Хогланда-Арнона I в условиях 10-часового фотопериода при интенсивности освещения 10 клк и температуре 25°С. После отделения от побегов корни инкубировали различное время в той же среде без добавок (контроль) или с добавлением эффекторов. Следует заметить, что отделение побегов от корней вызывает стресс, сопровождающийся повышением содержания в тканях АФК. 0 динамике стресса судили по эндогенному содержанию Н202.
Кончики корней гороха длиной 1 см гомогенизировали в ледяном ацетоне (300 мг корней в 1 мл ацетона при -20°С). Гомогенат центрифугировали в течение 15 мин при 12000 g. Супернатант использовали для анализа. В пробирку наливали равные объемы супернатанта и реактива, содержавшего 500 мкМ аммоний-сернокислое железо (II) (FeSO4(NH4)2SO4 ■ 6H2O), 50 мМ ксиленоловый оранжевый, 200 мМ сорбит, 50 мМ H2SO4 [14], и оставляли на 1 ч при комнатной температуре в плотно закрытой колбе в темноте. В каждом опыте стандартные кривые для Н202 строили в пределах 167-350 нМ/мл. Перед измерением опытные образцы разводили в 20 раз. Измерение проводили при длине волны 560 нм, используя в качестве контроля смесь, состоявшую из равных частей реактива и ацетона.
Детекцию фосфорилированных белков проводили при помощи иммуноблоттинга после разделения растворимых белков методом электрофореза и переноса белков на поливинилдифторные
(ПВДФ) мембраны. После инкубации с эффекторами кончики корней фиксировали в жидком азоте и гомогенизировали в среде (1 : 2), содержавшей: 50 мМ Трис-HCl, рН 7.5, 1 мМ дитиотрейтол (ДТТ), 1 мМ фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ), 10 мМ ЭДТА, 0.1 мМ ортованадат Na, 1 мМ теофиллин, 3%-ный поливинилпирролидон. Гомогенат центрифугировали в течение 10 мин при 14000 g и 5°С. Приготовление образца для одномерного электрофореза проводили смешиванием буфера, содержавшего 187.5 мМ Трис-HCl, рН 8.0, 6%-ный ДДС, 15%-ный меркаптоэтанол, 30%-ный глицерин, 0.004%-ный бромфеноловый синий с супернатантом в соотношении 1 : 3.
Белки разделяли методом одномерного электрофореза [15] в 6-20%-ном ПААГ. Количество белка, нанесенного на трек, составляло 25 мкг.
После проведения электрофореза белки переносили на ПВДФ-мембраны в течение 60 мин при постоянной величине электрического тока 150 мА, используя прибор для полусухого блот-тинга. Затем мембраны в течение ночи блокировали при 5°С 1%-ным бычьим сывороточным альбумином (БСА), растворенным в ТБСТ (10 мМ Трис-HCl, рН 7.5, 100 мМ NaCl, 0.05%-ный Твин-20). Блоты инкубировали 1 ч при комнатной температуре с антителами к фосфотирозину PY20, конъюгированными с пероксидазой хрена, в разведении 1 : 1000 в ТБСТ. Для визуализации тирозинового фосфорилирования белков блоты инкубировали 1 мин в ECL-реагенте и экспонировали на рентгеновской пленке. Специфичность связывания антител с фосфотирозиновыми белками гороха проверяли с помощью фосфотирози-на. Для этого PY20 инкубировали со свободным фосфотирозином в концентрациях 0.005, 0.1, 1 и 10 мМ в течение 30 мин при комнатной температуре. После проведения блоттинга мембраны в течение ночи блокировали, как описано выше, а затем 1 ч с комплексом PY20-фосфотирозин.
Для визуализации белков мембраны окрашивали 0.1%-ным спиртовым раствором Кумасси R-250 в течение 10 мин, затем отмывали 50%-ным этанолом. Для вычисления удельного тирозинового фосфорилирования белков, разделенных электрофоретически, мембраны, окрашенные Кумасси R-250, и рентгеновские пленки сканировали при помощи Epson Perfection 3170 Photo, и данные переводили в числовые значения оптической плотности при помощи программы Scion Image (Великобритания).
Удельное тирозиновое фосфорилирование выражали в относительных единицах как отношение оптической плотности фосфорилирован-ного белка (хемилюминесценции) на пленке к оптической плотности белка на мембране, окрашенной Кумасси R-250. Количество белка
кД 66-
45 36 29
(а)
кД
(б)
Рис. 1. Специфичность связывания фосфотирозиновых антител PY20 с белками экстракта корней 7-дневных растений гороха.
а - автограф фосфорилированных по тирозину полипептидов, б - окрашенные Кумасси R-250 полипептиды. 1 - контроль (без добавления фосфотирозина), 2 - 5 мкМ, 3 - 100 мкМ, 4 - 1 мМ, 5 - 10 мМ фосфотирозина. Нагрузка белка на трек при разделении при помощи одномерного электрофореза составила 25 мкг.
измеряли согласно методу Bradford [16], с БСА в качестве стандарта.
Эксперименты проводили в двух-трех повтор-ностях.
Реактивы. Трис, глицин, ДТТ, поливинилпир-ролидон, ДДС, тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД), бромфеноловый синий, персульфат аммония, ак-риламид, Кумасси R-250 и G-250, а также мети-лен-быс-акриламид - производства фирмы "BioRad" (США). Моноклональные антитела против фосфотирозина (клон PY20), ПВДФ-мембраны, хемилюминесцентный реагент (ECL-реагент), Твин-20 и БСА были получены от "Amersham Pharmacia Biotech" (Великобритания). ФМСФ, ЭДТА, фосфотирозин и теофиллин были поставлены фирмой "Sigma" (США). Остальные реактивы - NaCl, H2O2, ортованадат Na, глицерин, аммоний-сернокислое железо, ксиленоловый оранжевый, сорбит, H2SO4, а также рентгеновская п
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.