научная статья по теме ВЛИЯНИЕ НА НЕЙРОНЫ IN VITRO ТЕРАГЕРЦОВОГО (СУБМИЛЛИМЕТРОВОГО) ЛАЗЕРНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ Биология

Текст научной статьи на тему «ВЛИЯНИЕ НА НЕЙРОНЫ IN VITRO ТЕРАГЕРЦОВОГО (СУБМИЛЛИМЕТРОВОГО) ЛАЗЕРНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ»

ЖУРНАЛ ВЫСШЕЙ НЕРВНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ, 2009, том 59, № 3, с. 353-359

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ПАТОЛОГИЯ ВЫСШЕЙ НЕРВНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ

УДК 612.822.3 + 612.822.5 + 577.359

ВЛИЯНИЕ ИА НЕЙРОНЫ IN VITRO ТЕРАГЕРЦОВОГО (СУБМИЛЛИМЕТРОВОГО) ЛАЗЕРНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ

© 2009 г. Ю. С. Ольшевская, А. С. Козлов*, А. К. Петров*, Т. А. Запара, А. С. Ратушняк

Конструкторско-технологический институт вычислительной техники СО РАН, *Институт химической кинетики и горения СО РАН, Новосибирск,

e-mail: ratush@mail.ru Поступила в редакцию 25.06.2008 г.

Принята в печать 06.11.2008 г.

Появление и перспективы использования новых источников когерентного не ионизирующего излучения в диапазоне терагерцовых волн выдвинуло фундаментальные задачи выявления механизмов его действия на биологические объекты и в особенности на нервную систему. В рамках таких задач на первом этапе необходимо выявить эффекты, возникающие в сложно организованных молекулярных системах - нервных клетках при действии такого излучения. Это и являлось основной целью настоящей работы. В проведенных ранее исследованиях впервые показано наличие и высокая специфичность эффектов некоторых из исследованных длин волн на структурно-функциональные свойства нервных клеток. Действие на нейроны излучения лазера на свободных электронах приводило к зависимым от длины волны и мощности нарушениям морфологии клеток. Наблюдалось появление прозрачных незаполненных отросткоподобных выпячиваний мембраны, нарушение роста отростков и падение мембранного потенциала нейронов. На основе разработанной модели и полученных данных появляется возможность приблизиться к пониманию молекулярно-клеточных механизмов действия таких волн и возникает перспектива использования их в качестве инструмента для исследования функционирования нейронов и нейронных систем, а возможно, и для корректирующих воздействий при патологиях.

Ключевые слова: изолированные нейроны, конус роста, регенерация нейронной сети, терагер-цовые волны, субмиллиметровое излучение.

Influence of Terahertz (Submillimeter) Laser Radiation on Neurons IN VITRO

J. S. Olshevskaya, A. S. Kozlov, A. K. Petrov, T. A. Zapara, A. S. Ratushnyak

Design Technological Institute of Digital Techniques, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences, Institute of Chemical Kinetics and Combustion, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences, Novosibirsk,

e-mail: ratush@mail.ru

The development of new sources of coherent non-ionizing radiation in terahertz wave range put forward the basic problems of revealing the mechanism of its action on biological objects, especially, on the nervous system. At this point it is necessary to reveal the radiation effects on complex molecular systems such as nerve cells. It was the main objective of this study. In the previous study we were the first to demonstrate highly specific effects of some examined wavelengths on the structural-functional properties of the nerve cells. The radiation of a free-electron laser produced damage to neuron morphology dependent on the power and wavelength. Transparent blank protrusions of the membrane, disorders of the growth of processes, and fall of the membrane potential were observed. The model developed and the data obtained approach the understanding of the molecular mechanisms of the effect of the waves under study on cells. These waves can be probably used as a tool for further investigation of functioning of neurons and neural system and correction of some pathology.

Key words: isolated neurons, growth cone, regeneration of neural network, terahertz waves, submillimeter radiation.

Взаимодействие электромагнитных волн со сложно организованными молекулярными живыми системами, в том числе нервными

клетками, представляет как теоретический, так и практический интерес. Особенно важны знания о действии ранее не изученных излуче-

ний в терагерцовом (субмиллиметровом) диапазоне, их влияние на структурно-функциональную пластичность нейронных систем в процессе развития и регенерации после повреждений. Использование такого воздействия на молекулярные структуры нейронов позволяет надеяться, что на основе селективного изменения свойств определенных молекул появится возможность направленного вмешательства в функциональные механизмы работы клеток. Это может быть положено в основу нового способа воздействия на определенные молекулярные группы, более адресного и простого для анализа инструмента исследования работы нервных клеток. Однако для реализации такого подхода необходимо более детальное исследование самих эффектов терагерцовых волн на биообъекты. Из всего спектра электромагнитных волн этот диапазон частот (1011-1014 Гц) оказался менее всего изучен. Технические устройства, генерирующие когерентное излучение в этом волновом диапазоне, появились лишь недавно [1] и начинают активно использоваться как в физике и технике, так и в диагностических, физиотерапевтических методиках анализа и лечения болезней различных систем организма [2, 4]. Необходимо отметить, что природное излучение тера-герцового диапазона полностью поглощается атмосферой земли [5] и может оказаться, что механизмы толерантности к воздействиям излучения в этом диапазоне на биологические молекулы слабо развиты на всех уровнях организации живых систем, включая клеточный. В связи с этим приобретает значение и исследование биологической безопасности при использовании такого излучения [10].

Работа предпринята с целью изучения мор-фофункциональных изменений нервных клеток Lymnaea stagnalis in vitro после воздействия терагерцового лазерного излучения разных параметров.

МЕТОДИКА

Работа проведена на изолированных культивируемых вне организма нейронах моллюска Lymnaea stagnalis на различных стадиях регенерации нейронной сети. Для получения полностью изолированных нейронов использовали методику, разработанную в Институте биофизики РАН [3]. Этот метод основан на сочетании ферментативной обработки ткани с последующим механическим разделением клеточных агрегатов. Ферментативная обработка

ганглиев проводилась в физиологическом растворе, содержащем 0.3-0.5% проназы (Pronase, MERK, Germany) или протеазы (Protease type XIV, "Sigma", USA). Инкубацию ганглиев в солевом растворе, содержащем протеолитиче-ские ферменты, проводили в течение 20-40 мин при комнатной температуре или 12-18 ч при температуре 4°С. Для получения полностью изолированных нейронов проводили механическую дезагрегацию ганглиев. Культивирование нейронов осуществляли в физиологическом растворе следующего солевого состава (мМ): NaCl - 85, KCl - 1.6, CaCl2 - 4, MgCl2 - 1.5, трис-HCl - 8, рН - 7.6-7.8 без добавок аминокислот при температуре 6-8°С в специальных камерах на пластиковой подложке, прозрачной для волн исследуемого диапазона. Объем камер для культивирования был 0.5-1 мл. Температуру регистрировали электронным термометром, датчик которого помещался в рабочую камеру.

Исследовали влияние непрерывного субмиллиметрового лазерного излучения с длиной волны 1.079; 70; 81.5; 117; 122; 184; 418 мкм, мощность от 2 до 20 мВт/см2 и лазера на свободных электронах (Сибирского центра фотохимических исследований) с плавной перестройкой длины волны излучения (110-240 мкм), генерирующего последовательность импульсов длительностью от 30 до 100 пс с частотой повторения 5.6-11.2 мГц. Относительная спектральная ширина излучения составляла 0.31%. Средняя мощность достигала 400 Вт (пиковая до 1000 кВт). В наших экспериментах использовалась средняя мощность от 0.3 до 30 мВт/см2.

Электрофизиологические исследования проводили с использованием стеклянных микроэлектродов при 20-24°С. Микроэлектроды заполняли раствором KCl (2.5М). Электрическую активность регистрировали с использованием аппаратно-программного комплекса, включающего систему согласующих и нормирующих усилителей и аналого-цифровые и цифро-аналоговые преобразователи (L-CARD, Россия). Регистрацию мембранного потенциала (МП) нейронов начинали через 60 мин после воздействия излучения и представляли в виде графиков зависимости изменений МП от времени инкубации нейронов. Морфологические изменения регистрировали с помощью микроскопа ("Carl Zeiss", Germany) и видеокамеры ТР1001С ("A.KRUSS Optronic", Germany).

Усредненные результаты представлены как mean ± SEM (среднее ± стандартная ошиб-

А

Рис. 1. Примеры эффектов действия непрерывного лазерного излучения на разных этапах культивирования вне организма нейронов моллюска Lymnaea stagnalis при длине волны 81.5 мкм, мощности 1520 мВт/см2 и экспозиции 60 мин. А, Б, В - в контроле (А - до формирования отростков, Б, В - на стадии регенерации нейронной сети). Г, Д - через 40-50 ч после облучения. Е - через 15-20 ч после воздействия на стадии роста отростков. Масштаб 30 мкм.

Fig. 1. Examples of action of continuous laser irradiation at different stages of cultivation in vitro of neurons of Lymnaea stagnalis mollusks at wave length of 81.5 ^m, power 15-20 mW/cm2 and exposition 60 min А, Б, В - in the control (A - before formation of processes, Б, В - at the stage of neogenesis of a neural network). Г, Д - in 4050 h after irradiation. Е - in 15-20 h after influence at the stage of growth processes. The scale is 30 ^m.

ка среднего). Достоверность различий между группами нейронов оценивались по критерию U (Манна-Уитни).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

При действии на изолированные нейроны Lymnaea stagnalis лазерного излучения на длине волны 81.5 мкм и мощности 15-20 мВт/см2 были обнаружены отсроченные эффекты. Они проявлялись через 40-50 ч и состояли в изменении морфологии соматической мембраны, нейритов и конусов роста. У 12-15% клеток, во время облучения не имевших нейритов, отмечено перераспределение пигментных гранул и формирование неоднородностей цитокортикального слоя. В норме формирование нейритов наблюдалось по периметру зоны контакта клеток с подложкой. После облучения отросткоподобные не заполненные пигментными гранулами структуры появлялись, как обычно, при регенерации нейритов, по периметру зоны контакта клеток с подложкой, а кроме того, на свободной поверхности мембраны, не контактирующей с подложкой (рис.

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком