БИОХИМИЯ, 2014, том 79, вып. 11, с. 1493 - 1504
УДК 577.355.3
ВЛИЯНИЕ НАФТАЛИНА НА ФОТОХИМИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ФОТОСИСТЕМЫ 2*
© 2014 А.В. Ланкин1, В.Д. Креславский12**, А.Ю. Худякова3, С.К. Жармухамедов2**, С.И. Аллахвердиев1,2**
1 Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, 127276 Москва, ул. Ботаническая, 35; факс: (499)977-8018 2 Институт фундаментальных проблем биологии РАН, 142290Пущино Московской обл., ул. Институтская, 2; факс: 8(4967)330-532, электронная почта: vkreslav@rambler.ru, watcher01@rambler.ru, allakhverdiev@gmail.com 3 Институт биологического приборостроения РАН, 142290 Пущино Московской обл., ул. Институтская, 7; факс: 8(4967)330-522
Поступила в редакцию 20.06.14 После доработки 29.07.14
Изучали действие одного из типичных полициклических ароматических углеводородов, нафталина (Наф), на фотосинтетическую активность фотосистемы 2 (ФС-2) в препаратах тилакоидных мембран и листьях двадцатидневных растений гороха. Образцы инкубировали в воде в присутствии Наф (0,078, 0,21 и 0,78 мМ) при освещении белым светом (15 мкмоль квантов м-2 с-1) в течение 0,2—24 ч. Активность ФС-2 определяли с помощью методов быстрой и замедленной флуоресценции хлорофилла а. Инкубация образцов в водных растворах Наф при концентрациях 0,21 и 0,78 мМ приводила к понижению максимальной квантовой эффективности (Ру/Рш) ФС-2, значительным изменениям в полифазной кинетике индукции флуоресценции (ОЛР) и уменьшению амплитуд быстрой и медленных компонент замедленной флуоресценции хлорофилла а. Увеличивалась также скорость выхода электролитов из листьев, предварительно инкубированных в растворе Наф (0,21 мМ). Заметное снижение упомянутых флуоресцентных параметров в препаратах тилакоидных мембран наблюдали уже при концентрации Наф 0,03 мМ и 12-минутном выдерживании образцов. Содержание Хл a и Ь, а также каротиноидов (мг на 1 г сырого веса) изменялось незначительно. Обнаружено, что квантовые выходы переноса электрона от рА к рв (фБТ2о), а также вплоть до акцепторов фотосистемы 1 (фКЕ10) снижаются. Эти результаты объясняются увеличением количества рв-невосстанавливающих центров ФС-2, которое возрастало при увеличении концентрации Наф и времени экспозиции. Действие Наф, снижающее активность ФС-2, частично снималось в присутствии донора электрона, аскорбата натрия. На основе полученных данных предполагается, что Наф нарушает интактность клеточных мембран и действует, в основном, на акцепторную и, в меньшей степени, на донорную сторону ФС-2.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: нафталин, фотосистема 2, переменная и замедленная флуоресценция хлорофилла, отделенные листья гороха, тилакоидные мембраны, фотосинтетические пигменты.
В настоящее время большое значение придается исследованию процессов загрязнения окружающей среды разными поллютантами. Одними из наиболее распространенных и токсических поллютантов являются полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), содержащие, по крайней мере, два бензольных коль-
ца. ПАУ с двумя или тремя кольцами присутствуют в атмосфере, главным образом в газообразной фазе, тогда как с четырьмя кольцами или более преобладают в твердой фазе [1].
Содержащиеся в атмосфере ПАУ, такие как нафталин (два бензольных кольца) и фенантрен (три бензольных кольца), проникают в меж-
Принятые сокращения: ПАУ — полициклические ароматические углеводороды, Наф — нафталин, ФА — фотосинтетический аппарат, ФС-2 — фотосистема 2, Хл — хлорофилл, БФл — быстрая флуоресценция, ЗФл — замедленная флуоресценция, Аск — аскорбат натрия, ТМ — тилакоидная мембрана, F0 — минимальная флуоресценция, Fm — максимальная флуоресценция, Fv — переменная флуоресценция (Fv = F0 — Fm), QA — первичный хинонный акцептор ФС-2, QB — вторичный хинонный акцептор ФС-2, РЦ — реакционный центр.
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM14-177, 07.09.2014.
** Адресат для корреспонденции.
клетники листьев растений, в основном через устьица. С одной стороны, вследствие липо-фильности молекулы, ПАУ могут накапливаться в липидном слое мембран растений, главным образом в процессе их осаждения из атмосферы на поверхности листа [2]. С другой стороны, в виде растворимых в воде производных эти агенты достигают клеточной мембраны и вызывают нарушения ее интактности и увеличение проницаемости. Это может быть связано как с изменением соотношения ионов Н+ и Са2+ в мембранах, так и со снижением количества сульфгид-рильных групп ^Н) и, соответственно, увеличения в мембранных белках дисульфидных связей, а также с образованием в мембранных липидах дефектных областей вследствие накопления продуктов перекисного окисления липидов [3]. Предполагается, что действие экстремальных факторов, таких как ПАУ, ведет к нарушению функций мембран и их структуры. При этом происходит нарушение функционирования фотосинтетического аппарата (ФА), прежде всего фотосистемы 2 (ФС-2), которая наиболее уязвима к действию стрессовых факторов и поэтому может служить биоиндикатором действия ПАУ [4, 5].
Эффекты ПАУ зависят от продолжительности воздействия и физико-химических свойств молекулы поллютанта [4—6]. Окислительно-восстановительные свойства и липофильность агента, характеризующаяся коэффициентом распределения в системе октанол/вода, определяют эффективность проникновения ПАУ к молекулярным мишеням.
Одним из подходов для оценки фотохимической активности ФС-2 являются методы «переменной» быстрой флуоресценции (БФл) (ОЛР-переходы, ОЛР-1гаш1еп1:) и замедленной флуоресценции (ЗФл) Хл а [7—9]. При этом на основе кинетик индукционных кривых милли-секундной ЗФл и быстрой флуоресценции рассчитывают разные параметры, характеризующие фотохимическую активность ФС-2. Измерения БФл позволяют оценить максимальную квантовую эффективность фотохимии ФС-2, эффективность переноса электрона на разных участках ЭТЦ и ряд других параметров [8, 10, 11]. На основе кинетик ЗФл оценивают величину светоиндуцируемого образования трансмембранного градиента протонов (АрН) в тилакоид-ных мембранах и скорость переноса электрона на акцепторной стороне ФС-2 [7].
Растворимость практически всех ПАУ в воде низкая. Нафталин (Наф) среди остальных ПАУ обладает самой высокой растворимостью в воде, которая составляет при температуре 0 и 25° соответственно 0,148 и 0,268 мМ [12]. Предполага-
ется, что Наф, как типичный представитель ПАУ, из-за его низкой водной растворимости действует, прежде всего, на липиды клеточных мембран. При этом ПАУ типа Наф могут повреждать мембраны, в результате чего развивается окислительный стресс. Это приводит к снижению активности ФС-2 и деградации некоторых ее компонентов. Показано, что Наф вызывает снижение активности ФС-2, более быстрое, чем фенантрен и флуорантен [13]. Однако механизмы подавления активности ФС-2 при действии Наф еще неясны во многих деталях. Недостаточно изучены мишени действия Наф в ФС-2, быстрые ответные реакции ФА при действии Наф, когда образование продуктов его трансформации маловероятно. Следует заметить, что эксперименты с ПАУ во многих исследованиях занимают продолжительное время (2—6 недель) [4, 6], что усложняет понимание механизмов их воздействия на активность ФА.
В данной работе исследовано влияние различных концентраций Наф на фотохимическую активность ФС-2 и содержание фотосинтетических пигментов, а также на скорость поглощения Наф листьями и выход из них электролитов после кратковременной инкубации листьев в растворе Наф.
Получены данные, на основе которых предполагается, что Наф нарушает интактность клеточных мембран и действует, в основном, на акцепторную и, в меньшей степени, на донорную сторону ФС-2.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Условия выращивания растений. Эксперименты проводились на отделенных листьях гороха (Pisum sativum L. cv. Moscowski 559). Трехдневные проростки помещали в пластиковые сосуды (25 x 25 x 14 см, объемом 8,75 л), наполненные влажным песком, в который каждые 7 дней вносили 1/4 от конечного объема среды Кнопа. Растения выращивали в течение 20 дней при освещении белым светом с интенсивностью 360 мкмоль квантов м-2 с-1 (под лампами ДНАТ-400) и температуре 25 ± 1°.
Листья второго и третьего ярусов перед проведением измерений отделяли и помещали в чашки Петри с влажной фильтровальной бумагой на 1 ч для адаптации к свету белых люминесцентных ламп (15 мкмоль квантов м-2 с-1). Затем листья (6-7 шт.) помещали в закрытые стеклянные сосуды (объемом 100 мл), содержавшие 80 мл раствора Наф определенной концентрации, и инкубировали при тех же световых условиях при температуре 25 ± 0,5°. После инкубации листьев
в растворе нафталина в течение разных периодов времени (0,5—24 ч) проводили все необходимые исследования. Препараты тилакоидных мембран (ТМ) гороха (35 мг Хл/мл) получали, как описано ранее [13], и выдерживали с Наф (0,03 и 0,08 мМ) в течение 12 мин.
Приготовление образцов нафталина. Так как Наф имеет низкую растворимость в воде, то сначала готовили в 1000 раз более концентрированные ацетоновые растворы Наф («Sigma-Aldrich», США). Затем ацетоновый раствор вносили в дистиллированную воду с тем, чтобы получить конечные концентрации 0,078 и 0,21 мМ. Добавляли 0,1 мл исходного раствора к 100 мл дистиллированной воды. В некоторых опытах использовали перенасыщенные растворы Наф (номинальная концентрация Наф — 0,78 мМ), в которых некоторое его количество присутствовало в растворе в виде стабильной суспензии. В качестве контроля использовали дистиллированную воду с указанной концентрацией ацетона (0,1%).
Измерения флуоресценции хлорофилла. Фотосинтетическую активность ФС-2 оценивали путем измерения флуоресценции хлорофилла а (Хл а) с помощью методов быстрой и замедленной флуоресценции (БФл и ЗФл соответственно) после инкубации листьев в растворе Наф на свету в течение 1, 2 и 24 ч. Перед измерениями листья закрепляли внутри измерительной ячейки и выдерживали в темноте в течение 15 мин.
Уровень F0 и кинетику фотоиндуцирован-ных изменений выхода флуоресценции хлорофилла ФС-2 измеряли с помощью PAM-флуо-риметра (XE-PAM, «Heinz Walz», Германия). Индукционные кривые БФл, OJIP-переходы (возрастани
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.