ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2012, № 3, с. 279-287
БИОЛОГИЯ РАЗВИТИЯ
УДК 576.591
ВЛИЯНИЕ НАНОЧАСТИЦ ЗОЛОТА НА СПЕРМАТОГЕНЕЗ МЫШЕЙ
© 2012 г. С. Т. Захидов*,**, С. М. Павлюченкова***, Т. Л. Маршак**, В. М. Рудой***, О. В. Дементьева***, И. А. Зеленина*, С. Г. Скуридин****, А. А. Макаров*****,
А. Н. Хохлов*, Ю. М. Евдокимов****
*Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический ф-т, 119991 Москва, Ленинские горы, 1, стр. 12 **Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, 119334 Москва, ул. Вавилова, 26 ***Институт физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН, 119070 Москва, Ленинский просп., 31 ****Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, 119334Москва, ул. Вавилова, 32 ***** Национальный исследовательский университет "Высшая школа экономики", 101000 Москва, ул. Мясницкая, 20
E-maiM361.idb@bk.ru Поступила в редакцию 01.11.2011 г.
Проведено комплексное изучение реакции развивающихся мужских половых клеток мышей на воздействие наночастиц золота. Показано, что многократное введение животным наночастиц Au размером ~2.5 нм в целом не изменяло ход сперматогенеза, не нарушало структурную организацию сперматогенного эпителия и не оказывало выраженного мутагенного эффекта на сперматогониаль-ные стволовые клетки. Однако наночастицы золота индуцировали хромосомные мутации в ранних сперматоцитах I порядка, о чем свидетельствуют результаты подсчета частоты встречаемости округлых сперматид с микроядрами на 14-е сут последействия. С помощью метода деконденсации гаме-тического хроматина in vitro, вызываемой комбинированной обработкой додецилсульфатом Na и дитиотреитолом, установлено, что в опыте с многократным воздействием наночастиц золота на постмейотические клетки мышей большое число ядер эпидидимальных спермиев (14-е сут фиксации) проявило устойчивость к действию деконденсирующего агента. Эта устойчивость не уступала устойчивости нормальных зрелых гамет, не испытавших на себе в "раннем возрасте" действия наночастиц Au. Напротив, в опыте с однократным воздействием наночастиц золота на те же клетки и при том же сроке фиксации процесс индуцированной декомпактизации хроматина в эпидидималь-ных спермиях шел в ускоренном темпе, и число гамет с полностью деконденсированными ядрами достигало 100% против 44% в контроле.
Изучение генетических и биологических эффектов наночастиц, т.е. частиц размером от 1 до 100 нм приобретает в настоящее время большое значение и становится предметом многочисленных активных исследований, необходимость проведения которых диктуется не только чисто профессиональным, познавательным интересом, но и интересами безопасности здоровья человека и окружающего живого мира.
Как известно, наночастицы демонстрируют уникальные физические, физико-химические свойства, принципиально отличающие их от соответствующих микро- и макроскопических объектов. Наночастицы обладают высокой проникающей способностью, для них практически нет барьеров. Двигаясь внутри клеток по каким-то своим специфическим "траекториям", они способны порождать множество свободных радикалов и активных мутагенных молекул, возбужденные состояния, подавлять каталитические центры в ферментах и, как следствие, усиливать генетическую нестабильность. Обнаружение и
инвентаризация наночастиц, обладающих гено-и цитотоксичностью — одна из самых актуальных задач экспериментальной нанотоксикологии.
В последние годы особое внимание привлекают наночастицы золота, поскольку открываются перспективы их широкого использования в научных исследованиях, в промышленности, в медицине, в частности, для выявления и прицельного поражения раковых клеток. Между тем четкие представления о токсичности наночастиц Аи еще не выработаны. В то же время в модельных опытах строго доказана способность наночастиц золота разного размера проникать в молекулу ДНК и располагаться в ее широкой бороздке, что, в свою очередь, сопровождается возмущением структуры частиц холестерической жидкокристаллической дисперсии ДНК, моделирующих состояние генетического материала в составе некоторых биологических систем (Скуридин и др., 2010, 2011).
Показано также (^^апккк а1, 2009; Скуридин и др., 2010; Захидов и др., 2010), что в услови-
ях in vitro наночастицы золота оказывают весьма сильные сперматотоксические эффекты. Они подавляют локомоторные функции спермиев, нарушают структурную организацию ядер, препятствуют деконденсации гаметического хроматина, которая играет ключевую роль в процессах образования мужского пронуклеуса, развития зигот и эмбрионов.
В статье приводятся результаты экспериментов по изучению влияния наночастиц золота на процессы развития мужских половых клеток в гонадах у мышей.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследований служили половозрелые (3-4-месячные) самцы мышей Fl-гибридов CBA x C57B1/6. Животные, разделенные на контрольную (n = 6) и подопытную группу (n = 10), содержались в обычных условиях вивария и получали пищу и воду ad libitum.
Синтез коллоидного раствора (гидрозоля) золота был выполнен по методу Даффа (Duff et al, 1993), основанному на восстановлении ионов
AuCl- хлоридом тетракисгидроксиметилфосфо-ния в водном растворе щелочи (NaOH). По данным динамического рассеяния света и просвечивающей электронной микроскопии высокого разрешения средний размер частиц Au равнялся примерно 2.5 нм, их числовая концентрация составляла около 1 х 1015 мл-1. Исходный гидрозоль наночастиц золота хранили в темноте при температуре 4°С и использовали через 2.5 мес. после приготовления (Yevdokimov et al., 2011).
Мышам из первой подопытной и контрольной групп ежесуточно в течение четырех суток внут-рибрюшинно вводили по 0.2 мл неразбавленного гидрозоля золота в концентрации 1 х 1015 частиц/мл или физиологического раствора соответственно. Подопытным и контрольным мышам из второй группы вводили однократно наночастицы золота или физиологический раствор соответственно.
Забой животных производили путем дислокации шейных позвонков на 14-е сут (оба эксперимента) и 56-е сут (только первый эксперимент) после начала опыта, извлекали семенники и эпи-дидимисы.
Для гистологического анализа один из семенников каждого животного фиксировали в растворе Буэна в течение 4 сут. После этого гонады обезвоживали в растворах этанола возрастающей концентрации, заливали в парафин и готовили срезы толщиной 7 мкм. После окрашивания гематоксилин-эозином по методу Караччи приготовленные препараты просматривали с помощью оптического микроскопа "Leica DM RXA2" (Германия).
Для цитогенетического анализа другой семенник разрезали пополам и готовили отпечатки сперматогенных клеток. Препараты фиксировали в 10%-ном забуференном растворе формалина (pH 7.2) в течение 10—15 мин. После отмывки препараты окрашивали по Фельгену: гидролиз в 5 N HCI при 37°C в течение 11 мин с последующим окрашиванием в реактиве Шиффа в течение 1 ч при комнатной температуре.
Для оценки генотоксичности наночастиц золота были применены методы учета сперматого-ниальных и мейотических микроядер и определения частоты встречаемости спермиев с морфологически аномальными головками. Для этого на препаратах, окрашенных по Фельгену, анализировали 300—500 сперматогониев, не менее 1000 округлых сперматид и не менее 300 спермиев от каждого животного. Число клеток со следами хромосомных поломок выражали в промилле, а число аномальных гамет выражали в процентах.
Для оценки влияния наночастиц золота на организацию хроматина в ядрах клеток Сертоли проводили подсчет числа гетерохроматиновых глыбок на окрашенных по Фельгену препаратах.
Влияние наночастиц золота на организацию ядерного материала созревающих спермиоген-ных клеток оценивали по результатам деконден-сации хроматина гамет in vitro на 14-е сут после однократного и многократного введения наноча-стиц золота. Метод деконденсации ядер зрелых спермиев имитирует образование мужского про-нуклеуса и позволяет выявлять скрытые повреждения в структурной организации дезоксинук-леопротеидного (ДНП) комплекса.
Каудальные отделы эпидидимисов, извлеченных на 14-е сут после однократного и многократного воздействия наночастиц Au, помещали в каплю физиологического раствора, тщательно измельчали и готовили суспензию спермиев. После центрифугирования (1000 g, 15 мин) надоса-дочную жидкость сливали, к осадку спермиев добавляли 1 мл 1%-ного раствора додецилсульфата натрия (SDS, Sigma, USA), поверхностно-активного вещества, разрушающего плазматическую мембрану. Полученную суспензию инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин, а затем добавляли 0.3 мл 0.01 М раствора дитиотре-итола (ДТТ, Sigma) в трис-HCl буфере (pH 8) и продолжали инкубацию в течение 20 и 40 мин при комнатной температуре. Как известно, тиоловый реагент ДТТ разрушает перекрестные дисульфид-ные мостики в структуре плотноупакованного хроматина гамет и тем самым способствует де-компактизации и разбуханию ядер. После завершения инкубации спермиев в деконденсирующей среде готовили мазки. Препараты фиксировали в 96%-ном этиловом спирте в течение 10 мин, окрашивали 0.1%-ным раствором толуидинового си-
Рис. 1. Срезы семенников контрольных (а, в) и подопытных (б, г) мышей: а, б — 14-е сут фиксации; в, г — 56-е сут. Н — канальцы с нормальной структурой, ОТ — отслоение сперматогенного эпителия, СЛ — слущивание клеток в просвет канальца. * — клетки Сертоли. Окраска гематоксилин-эозином.
Н
/ *Ф
Л * г.
■ • < g , • • «
(а) - 20МКМ
Н
уч
ï L"
. J, » -
"...
" ß\ I
(б)
I * «4 . Ä , 4.
*
. 2° мкм
ж
> V '
• •
\ N \ • Г \
• \ \ \ - *
ОТ^
* „
Г-.г" «
* - § .
(в)
« V .
AVA
; - v ' * " 2° мкм
• •
* * if
Mi .. *
: J»
СЛ
41
Y
* ™
2° мкм
(г) I_I
него (Fluka, Швейцария) и анализировали с помощью микроскопа Opton (ФРГ) при общем увеличении х1000, просматривая в среднем 100 случайно выбранных полей зрения.
Обработку цифрового материала проводили с помощью статистического пакета SPSS. Для определения достоверности различий использовали непараметрический критерий Вилкоксона для стандартного 5%-ного уровня значимости.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Морфогистол
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.