РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2007, том 47, № 1, с. 5-9
^ ОБЩАЯ
РАДИОБИОЛОГИЯ
УДК 599.5391.047
ВЛИЯНИЕ НЕКОТОРЫХ ИНГИБИТОРОВ NOS ИЗ ДИГИДРОТИАЗИН-ТИАЗОЛИНОВОГО РЯДА НА ПОСТРАДИАЦИОННОЕ ВОССТАНОВЛЕНИЕ ЭНДОГЕННЫХ
КОЕ-С-8 У МЫШЕЙ
© 2007 г. А. Г. Коноплянников1, С. Я. Проскуряков1*, O.A. Коноплянникова1, А. И. Тришкина1, Л. В. Штейн1, Ю. Г. Верховский1, А. И. Колесникова1, Т. П. Трофимова2, А. А. Мандругин2, В. М. Федосеев2, С. O. Бачурин3, А. Н. Прошин3, В. Г. Скворцов1
1Медицинский радиологический научный центр РАМН, Обнинск 2Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Химический факультет, Москва 3Институт физиологически активных веществ РАН, Черноголовка
В работе сделана попытка оценить роль оксида азота (NO ) в регуляции численности пула стволовых кроветворных клеток у облученных мышей. С этой целью был синтезирован ряд новых соединений из дигидротиазин-тиазолинового класса, изучена in vivo методом ЭПР-спектроскопии спиновой ловушки их NO-ингибирующая активность и влияние на выход эндогенных селезеночных колоний мышей после общего воздействия у-излучения в сублетальной дозе 6 Гр. Показано, что испытанные соединения снижали содержание NO в ткани печени мышей, получивших инъекцию липополисахарида (индуктора синтеза оксида азота), а также увеличивали выход КОЕ-С-8, формирующих эндогенные колонии в селезенке облученных мышей. Полученные данные свидетельствуют о перспективности поиска радиопротекторных агентов среди ингибиторов синтеза NO .
Оксид азота, радиопротекторный эффект, эндогенные селезеночные колонии, ЭПР-спектро-скопия спиновой ловушки.
Клетки крови, генерируемые гемопоэтиче-ской системой взрослых организмов, происходят из небольшого пула плюрипотентных стволовых кроветворных клеток, располагающихся по преимуществу в красном костном мозге (КМ). Известно, что их пролиферативная активность существенно ограничена и многие стволовые кроветворные клетки в стационарном состоянии этой системы клеточного обновления находятся в Go-периоде. Такое состояние предохраняет этот пул клеток от преждевременного истощения в результате воздействия различных стрессовых воздействий. Сигнальные системы, контролирующие клеточную численность стволового пула, остаются мало изученными, и пока описано лишь несколько таких регуляторов [1, 2].
Оксид азота (NO' ), представляющий собой многофункциональную сигнальную молекулу, может быть потенциальным регулятором гомеостаза ранних предшественников кроветворения. Экспрессия различных изоформ NO-синтазы (NOS) обнаружена в КМ и клеточных элементах крови
*Адресат для корреспонденции: 249036 Обнинск, Калужская обл., ул. Королева, 4, ГУ МРНЦ РАМН; тел.: (48439) 7-44-96, факс: (48439) 7-48-63; e-mail: pros@mrrc.obninsk.ru.
человека и грызунов [3-7]. Показано также, что экзогенные NO-доноры способны угнетать пролиферацию различных субпопуляций клеток КМ человека, и в частности, подавлять образование миелоидных и эритроидных колоний CD34+-клет-ками [8, 9].
В настоящей работе мы показали, что ингиби-рование NOS in vivo приводит к существенному ускорению пострадиационного восстановления пула эндогенных КОЕ-С-8, что может свидетельствовать об участии no в механизмах регуляции численности стволовых клеток КМ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
В экспериментах была изучена биологическая активность гидробромида следующих соединений: 2-амино-2-тиазолин (2-АТ); 2-бензиламино-2-тиазолин (2-БТ), 2-амино-5,6-дигидро-4#-1,3-тиазин, (2-АДТ); 2-ацетиламино-5,6-дигидро-4#-1,3-тиазин, (2-ААДТ) и 2-бензоиламино-5,6-ди-гидро-4#-1,3-тиазин, (2-БАДТ) [10, 11], синтезированных на кафедре радиохимии Химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, а также 2-бензиламино-5,6-дигидро-4#-1,3-тиазин (2-БДТ),
Таблица 1. Влияние гетероциклических соединений из дигидротиазин-тиазолинового ряда на уровень содержания N0 в печени мышей, обработанных ЛПС
Доза препарата, мкмоль/кг Ингибирующая активность*
Дифетур 2-AT 2-БТ 2-АДТ 2-БДТ 2-БАДТ 2-ААДТ
0.3 1 10 20 50 100 60 ± 15 4 ± 2 2 ± 1 23 ± 3 9 ± 2.5 100 ± 25 70 ± 15 45 ± 11 5 ± 1 2 ± 1 32 ± 4 9 ± 1.5 61 ± 13 12 ± 3 2 ± 1 27 ± 4 7 ± 2 2 ± 1
* % к уровню NO в печени мышей, которым вводили только ЛПС.
синтезированный в Институте физиологически активных веществ (ИФАВ) РАН. "Дифетур" (ди-этилфосфат S-этилизотиомочевины) был любезно предоставлен В.Ю. Ковтуном (НПЦ "Фармза-щита", г. Химки).
Соединения, выделенные в виде солей, растворяли в 0.9%-ном растворе NaCl и вводили животным внутрибрюшинно. 2-БТ и 2-БДТ суспендировали в 3%-ном растворе крахмала и вводили внут-рижелудочно.
Исследование NO-ингибирующей активности синтезированных веществ проводили на белых неинбредных мышах-самцах (исходный генотип -линия Swiss) в возрасте 5 мес массой 27-30 г, содержавшихся в условиях лабораторного вивария и получавших стандартный рацион и воду без ограничений. Животным внутрибрюшинно вводили бактериальный липополисахарид (ЛПС) фирмы "Sigma" (0111:B4) в дозе 1.5 мг/кг в 0.5 мл физиологического р-ра на мышь. Через 3 ч после этого мышам вводили испытываемые препараты и еще через 1 ч животных подвергали эвтаназии эфиром и извлекали пробы печени. Продукцию
no в них определяли с помощью ЭПР-спектро-скопии спиновой ловушки по методу Ванина и сотр. [12, 13].
Для изучения выживаемости стволовых кроветворных клеток использовали методику селезеночных эндоколоний [14]. Мышей после введения испытываемых препаратов или без них подвергали общему воздействию у-излучения (аппарат "Луч", мощность дозы - 0.5 Гр/мин) в дозе 6 Гр и забивали через 8 сут для фиксации селезенок и подсчета на их поверхности клеточных колоний диаметром 0.2 мм и более, образованных за счет пролиферации выживших стволовых кроветворных клеток.
Опыты проводили на мышах-гибридах F1 (CBA х C57B1/6), самцах массой 20-22 г в возрасте 3 мес, находившихся в условиях содержания и кормления лабораторного вивария. Ингибиторы
NOS в 0.2 мл стерильного физиологического раствора вводили в/б мышам за 10 мин до облучения или внутрижелудочно в виде суспензии в растворе крахмала за 30 мин до облучения. Через 8 сут извлекали селезенки мышей, фиксировали их для подсчета на поверхности числа колоний, образованных выжившими стволовыми клетками, которые принято обозначать как КОЕ-С-8. В каждой группе в этих опытах было по 12 мышей. Статистическую обработку среднего числа селезеночных колоний проводили согласно методическим рекомендациям [15].
Данные приведены в виде средних ± стандартное отклонение. Статистические различия средних значений устанавливали с помощью дисперсионного анализа и по критерию Ньюмена-Кейл-са [16].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Как следует из многочисленных наших и литературных данных введение экспериментальным животным ЛПС за 4-6 ч до извлечения образцов
ткани приводит к повышению содержания no радикала в печени в 15-30 раз [17]. В настоящем исследовании мышам вводили модификаторы синтеза no через 3 ч после введения ЛПС и за 30 мин до инъекции животным спиновой ловушки. В табл. 1 приведены данные о влиянии испытанных соединений на уровень содержания no . Видно, что наименее активными соединениями являются 2-БТ и 2-БДТ. Даже после введения их
в дозе 100 мкмоль/кг содержание no' достоверно не отличалось от уровня радикала в ткани печени интактных животных. Если воспользоваться величиной, характеризующей дозу модификатора, которая вызывает 50%-ное уменьшение
уровня содержания no ' в образце ткани (50%-ная ингибирующая доза, ИД50), то можно заклю-
Таблица 2. Выживаемость КОЕ-С-8, оцениваемая по выходу селезеночных эндоколоний у мышей, облученных в дозе 6 Гр, получивших перед облучением различные ингибиторы NOS
Среднее количество колоний на селезенку, M ± m
контроль 6 Гр дифетур (0.6)* 2-AT (0.5) 2-БТ (0.2) 2-АДТ (0.8) 2-БДТ (0.2) 2-БАДТ (0.5) 2-ААДТ (0.6)
3.2 ± 0.4 2.0 ± 0.2 2.6 ± 0.4 2.5 ± 0.6 6.2 ± 0.6 6.7 ± 0.7 5.3 ± 0.7 9.2 ± 1.3 8.5 ± 0.9 5.8 ± 0.9 3.8 ± 0.7** 6.1 ± 0.8
* В скобках указана доза препарата в ммоль/кг. ** Доза препарата - 0.05 ммоль/кг.
чить, что для производных дигидротиазина (2-АДТ, 2-БАДТ и 2-ААДТ) ИД50 была меньше 10 мкмоль/кг. Вещество с такой активностью in vivo по сравнению с другими известными ингибиторами можно отнести к высокоактивным соединениям [18]. Следует отметить, что в опытах in vivo более точная оценка вряд ли возможна, поскольку при столь малых дозах вещества существенную роль начинает играть не сродство ингибитора к ферменту, а другие физиологические факторы (фармакокинетика, метаболизм, мембранный транспорт и др.). В частности, по данным, полученным в экспериментах с выделенным ферментом, аналогичные величины - константы ингиби-рования (K), характеризующие сродство ингибитора к ферменту различались почти в 10 раз (для 2-Ат K = 0.26 мкмоль/л; а для S-этилизотиомоче-вины дигидробромида (аналог "Дифетура") K = = 0.02 мкмоль/л) [19].
Все указанные выше соединения были исследованы как потенциальные модификаторы радиационного ответа стволовых клеток кроветворения по критерию выхода КОЕ-С-8 после облучения в сублетальной дозе 6 Гр (табл. 2). Препараты в большинстве случаев вводили в максимально толерантной дозе. В таких дозах эти соединения не могли быть испытаны в опытах по ингибиро-
ванию синтеза NO , так как вместе с другими компонентами спиновой ловушки они были слишком токсичны. В целом изученные препараты оказывали достоверное радиопротективное действие на выживаемость стволовых клеток. Следует отметить, что радиопротективный эффект по выживаемости КОЕ-С-8 зависел от дозы препаратов. В частности, БАДТ в дозе 0.5 ммоль/кг увеличивал число селезеночных эндоколоний почти в 3 раза, а при дозе в 10 раз меньшей - почти в 2 раза. Наибольший защитный эффект 2-АДТ, по-видимому, определялся его высокой дозой -0.8 ммоль/кг.
Можно с большой долей вероятности предположить, что в радиозащитном эффекте соединений, содержащих тиоамидиновый фрагмент в структуре и обладающих NO-ингибирующей активностью, определенную роль играет механизм гипоксической защиты. Как следует из литературных данных [18], соединения подобной структуры не различаются значительной специфичност
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.