ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 3, с. 424-431
УДК 581.1
ВЛИЯНИЕ НИТРАТОВ, ВВОДИМЫХ С ТРАНСПИРАЦИОННЫМ ТОКОМ ВОДЫ, НА ТРАНСПОРТ АССИМИЛЯТОВ
© 2007 г. С. Н. Баташева, Ф. А. Абдрахимов, Г. Г. Бакирова, В. И. Чиков
Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской академии наук, Казань Поступила в редакцию 15.06.2006 г.
В срезанные побеги льна-долгунца (Ьтит usitatissimum L.) длиной 50-60 см под давлением 104 Па вводили растворы нитратов (К^03, 0.5%; КН4К03, 0.2%) или мочевины (0.15%). Через 1 ч после начала введения растворов на срединную часть побега (14С-донорный участок) надевали ассимиляционную камеру-прищепку, через которую на свету продували 14С02 в течение 2.5 мин. Анализ распределения 14С среди меченых продуктов фотосинтеза листьев-доноров показал, что нитраты уменьшали включение метки в сахарозу, при этом снижалось соотношение меченых сахароза/гек-созы и сильно увеличивалось поступление метки в серин. Мочевина не вызывала подобных эффектов. Распределение 14С по растению спустя 3 ч после ассимиляции 14С02 свидетельствует о торможении оттока ассимилятов из листьев растений "нитратного варианта". У растений, в которые вводили воду или мочевину, ниже 14С-донорного участка побега оказывалось 17-20% меченого углерода, а при введении нитратов - 3-5%. У последних в лубяной ткани ниже листа-донора больше 14С содержалось в белках и меньше - в низкомолекулярных веществах. В древесной ткани такой закономерности не наблюдали. В 14С-донорных листьях содержание 14С в сахарозе через 3 ч снижалось с 55-60% до 38-42% при введении в побег воды или мочевины и повышалось с 50% до 62-73% при введении нитратов. Радиоавтография 14С-донорных листьев показала, что при введении воды или мочевины метка содержалась, в основном, в крупных сосудистых пучках, а у "нитратных" растений - вне крупных пучков. С помощью электронной микроскопии у "нитратных" растений обнаружили сильную вакуолизацию клеток-спутников флоэмных окончаний.
Linum usitatissimum - фотосинтез - апопласт - азотное питание - нитрат - транспорт ассимилятов - углеродный метаболизм
ВВЕДЕНИЕ
В многочисленных исследованиях показано, что повышенное азотное питание растений усиливает неуглеводную направленность фотосинтеза [1], при этом возрастает включение 14С из 14С02 в продукты гликолатного пути [2, с. 114] и тормозится отток ассимилятов из листьев [3]. Эти изменения, в основном, связаны с действием нитратного азота [4]. Включение в метаболизм нитрата регулируется фотосинтезом и интенсивно протекает только в световой период, а поглощаемый ночью в незначительных количествах нитрат используется почти исключительно на пополнение его свободного пула в листе [5]. Подавляющее большинство из известных нам исследований роли азотного питания в регуляции фотосинтеза
Адрес для корреспонденции: Чиков Владимир Иванович. 420111 Казань, ул. Лобачевского, 2/31. Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН. Факс: 007 (843) 292-7347; электронная почта: chikov@mail.knc.ru
целых растений проводилось в условиях измененного уровня поступления N03 через корни. Последнее не позволяло определенно утверждать, что обнаруживаемые эффекты прямо связаны с действием нитрата на лист. В связи с этим мы провели опыты с прямым введением в апопласт растения растворов, содержащих как окисленный (нитраты), так и восстановленный (мочевина) азот.
МЕТОДИКА
Объектом исследований был выбран лен-долгунец (Опиш usitatissimum Ь.), который в период быстрого роста имеет многочисленные равнозначные завершившие рост листья-доноры ассимилятов и выраженный акцептор продуктов фотосинтеза - верхнюю часть побега, которая может прирастать в это время со скоростью до 4 см в сутки [6, с. 13]. Кроме того, лен оказался удобным объектом, поскольку его срезанный побег при принудительной подаче в стебель воды мог
существовать без видимых повреждений в течение нескольких дней. Условия выращивания растений и методика введения в срезанный побег различных растворов были такими же, как описано в работе [7].
Известна особая роль калия в качестве противо-иона при транспорте нитрата по растению [8, 9], поэтому для сравнения нитраты вводили в побег в виде растворов KNO3 (0.5%), NH4NO3 (0.2%) как источники окисленного азота или мочевины (0.15%) как источник восстановленного азота с помощью установки (рис. 1). Стебель опытного растения через специальное приспособление присоединяли к силиконовой трубке, подающей в побег под давлением исследуемый раствор или воду. На поверхность раствора в трубке оказывалось стабилизированное (1 м водяного столба) давление воздуха, близкое к величине корневого давления (104 Па).
Подкормку срединной части побега 14С02 осуществляли при естественном освещении, как показано на рис. 1. После 2.5-минутного экспонирования в 14С02 растение срезали и разделяли на части. Находившуюся в фотосинтетической камере часть побега (14С-донорный участок) - разделяли на листья и стебель. Части побега выше и ниже 14С-донорной (исключая верхушку) разделяли на листья, кору (на иллюстрациях обозначено как луб) и древесину. Все части через 30 с после прекращения ассимиляции 14С02 одновременно фиксировали кипящим 80%-ным этанолом. После растирания проводили вторую экстракцию 60%-ным этанолом (условно - фракция низкомолекулярных соединений), которую, объединив с первой, анализировали с помощью бумажной двумерной хроматографии [10].
После экстракции спирто-водорастворимых соединений из оставшегося осадка экстрагировали белки с помощью Тритона Х-100, а затем определяли радиоактивность во всех трех фракциях (растворимых соединениях, белках и оставшихся в осадке полисахаридов). Радиоактивность проб, так же как и пятен на хроматограммах, соответствующих меченым продуктам фотосинтеза, определяли на сцинтилляционном счетчике Delta-300 ("Tracor Analytic", США).
В параллельном опыте 14С-донорные листья растений, в которые вводили воду или раствор KNO3 (1%), через 2 ч после 2.5-минутного экспонирования их на свету в 14С02, быстро помещали между слоями толстого ватмана. Радиоавтографы целых листьев получали по методике, описанной в работе [11], с некоторыми изменениями. Высушенные листья наклеивали верхней стороной на ватман, а затем в темноте к нижней поверхности листа на 24 ч прижимали рентгеновскую пленку. Экспонирование листьев на рентге-
Верхушка
Верхняя часть
Донорная часть
Нижняя часть
Рис. 1. Схема постановки эксперимента: способ введения растворов в побег льна-долгунца; участок, ассимилирующий 14С02, и разделение стебля на зоны.
1 - манжета для герметичного закрепления срезанного растения; 2 - силиконовая трубка по которой подается исследуемая жидкость в растение; 3 - ванна с водой и погруженным в нее на глубину 100 см моноста-том (4) для сброса избытка давления; К - компрессор.
новской пленке осуществляли при минусовой (-10°С) температуре. Негатив радиоавтографа с помощью сканера Epson Perfection 4990 Photo ("Epson", США) переводили в электронный вид и увеличивали.
Электронно-микроскопический анализ проводили по стандартной методике [12]. Ультратонкие срезы получали на микротоме LKB-III ("LKB", Швеция). Препараты просматривали под электронным микроскопом JEM-1200 EX (Япония).
Все опыты проводили в 5-7-кратной биологической повторности. На таблицах и графиках представлены средние значения со стандартной ошибкой. В работе обсуждаются только показатели, различающиеся с достоверностью не менее 0.95.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Введение в апопласт растворов нитратов вызвало сильное снижение фиксации 14С02 по сравнению с контролем (введение воды) и введением мочевины. Так, при введении KNOз и N^N03 радиоактивность побега после фиксации 14С02 составила (4.76 ± 0.93) х 106 имп./мин и (6.31 ± 1.73) х х 106 имп./мин соответственно, в то время как при введении воды и мочевины - (9.44 ± 1.50) х х 106 имп./мин и (9.35-2.00) х 106 имп./мин соответственно. Ассимиляция 14С02 при введении
Таблица 1. Влияние введения в растение льна-долгунца с транспирационным током азотсодержащих веществ на распределение 14С среди меченых продуктов после 2.5-минутной фотоассимиляции 14С02 донорными листьями льна-долгунца (% от радиоактивности спирто-водорастворимой фракции)
Соединение Вода Мочевина Ш4Ш3 КШ3
Сахароза 60.1 ± 2.5 55.6 ± 1.6 48.9 ± 1.7 51.4 ± 1.6
ФЭС* 7.7 ± 0.7 8.8 ± 1.1 10.8 ± 1.9 7.2 ± 0.9
Гексозы 4.9 ± 1.2 4.0 ± 0.8 5.6 ± 0.9 5.4 ± 0.8
Аминокислоты 14.6 ± 1.2 16.8 ± 0.8 19.2 ± 0.5 22.8 ± 0.7
в том числе
глицин 1.3 ± 0.1 0.8 ± 0.1 1.4 ± 0.2 0.9 ± 0.2
серин 3.3 ± 0.3 2.9 ± 0.3 4.4 ± 0.3 9.2 ± 0.8
аланин 8.0 ± 0.8 8.7 ± 0.6 6.6 ± 0.2 8.1 ± 0.2
аспартат 0.8 ± 0.0 1.6 ± 0.3 1.0 ± 0.1 1.3 ± 0.1
глутамат 0.5 ± 0.1 0.8 ± 0.1 1.1 ± 0.1 1.1 ± 0.1
лейцин 0.4 ± 0.1 1.4 ± 0.3 3.9 ± 0.3 1.6 ± 0.5
0рг. кислоты 5.9 ± 0.8 9.9 ± 1.0 7.9 ± 0.6 7.5 ± 0.9
в том числе
глицерат 3.3 ± 0.5 3.2 ± 0.4 3.2 ± 0.8 2.9 ± 0.2
малат 1.8 ± 0.2 4.1 ± 0.2 3.5 ± 0.3 3.0 ± 0.6
цитрат 0.3 ± 0.1 0.8 ± 0.2 0.8 ± 0.2 0.7 ± 0.2
0лигосахариды 2.0 ± 0.1 1.8 ± 0.1 3.6 ± 0.8 1.5 ± 0.3
Пигменты 0.9 ± 0.1 1.1 ± 0.1 1.2 ± 0.1 0.9 ± 0.1
Прочие 3.9 2.0 2.8 3.3
* Фосфорные эфиры сахаров.
КИ4К03 занимала промежуточное положение между КК03 и мочевиной (или водой).
Анализ распределения 14С среди низкомолекулярных меченых продуктов фотосинтеза зрелых листьев-доноров - 14С-ассимилятов показал, что введение в апопласт побега азотсодержащих веществ по сравнению с контролем (вода) снизило углеводную направленность фотосинтеза (табл. 1). Основное снижение произошло за счет транспортного соединения - сахарозы. Однако под действием мочевины это эффект был минимален (на грани достоверного), а у "нитратных" вариантов -ярко выражен. Введение нитратов снизило соотношение меченых сахароза/гексозы по сравнению с контролем, а введение мочевины повысило этот показатель. Обращает на себя внимание интенсивное поступление 14С в серин при введении в растение нитратов (особенно КК03) (табл. 1).
Судьба экспортированных из донорного участка побега меченых ассимилятов у растений, в которые вводили воду или мочевину, радикально отличалась от таковой у "нит
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.