научная статья по теме ВЛИЯНИЕ НОКАУТА ГЕНА -КАРБОАНГИДРАЗЫ 4 НА ФОТОСИНТЕТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ARABIDOPSIS THALIANA И НАКОПЛЕНИЕ КРАХМАЛА В ЛИСТЬЯХ Биология

Текст научной статьи на тему «ВЛИЯНИЕ НОКАУТА ГЕНА -КАРБОАНГИДРАЗЫ 4 НА ФОТОСИНТЕТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ARABIDOPSIS THALIANA И НАКОПЛЕНИЕ КРАХМАЛА В ЛИСТЬЯХ»

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2015, том 62, № 4, с. 602-608

КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ

УДК 581.1

ВЛИЯНИЕ НОКАУТА ГЕНА а-КАРБОАНГИДРАЗЫ 4 НА ФОТОСИНТЕТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ Arabidopsis thaliana И НАКОПЛЕНИЕ КРАХМАЛА В ЛИСТЬЯХ

© 2015 г. Е. М. Журикова*, Л. К. Игнатова*, Г. А. Семенова**, Н. Н. Руденко*,

В. А. Мудрик*, Б. Н. Иванов*

*Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт фундаментальных проблем биологии РАН, Пущино **Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино Поступила в редакцию 03.12.2014 г.

Исследовали влияние нокаута гена, кодирующего а-карбоангидразу 4 (а-КА4), на рост и фотосинтез резуховидки Таля (Arabidopsis thaliana (L.) Heynh., var. Columbia). Было найдено, что в мутантных растениях увеличен вес надземной части и повышено содержание крахмала в листьях. Электронная микроскопия выявила значительное увеличение количества и размера крахмальных зерен в хлоро-пластах мутантных растений. На основании сравнения измеренных в растении дикого типа и мутанте при насыщающей концентрации СО2 в воздухе и стационарном освещении параметров флуоресценции хлорофилла a листьев, коэффициента фотохимического тушения флуоресценции, эффективного квантового выхода ФС II и величины нефотохимического тушения флуоресценции, предположили, что а-КА4 участвует в развитии нефотохимической диссипации энергии, обеспечивая ускорение поставки протонов для активации виолаксантиндеэпоксидазы и структурных перестроек в светособирающих комплексах.

Ключевые слова: Arabidopsis thaliana — карбоангидраза — фотосинтез — нефотохимическое тушение — крахмал

DOI: 10.7868/S0015330315040211

ВВЕДЕНИЕ

В то время как функции карбоангидраз (КА) в метаболизме водорослей и цианобактерий считаются выясненными в значительной степени [1], роль этих ферментов в метаболизме высших растений остается во многом непонятной [2]. Их участие в протекании биохимических реакций и в трансмембранном переносе предполагается, как правило, на основе действия ингибиторов [3], а также модельных экспериментов и логических построений, основанных на кажущейся необходимости ускорения подачи или отвода в том или ином процессе одного из продуктов катализируемой карбоангидразами реакции

С02 + Н2О Н+ + НСО-,

Сокращения: ВДЭ — виолаксантиндеэпоксидаза; ДТ — дикий тип; КА — карбоангидраза; Хл — хлорофилл. Адрес для корреспонденции: Игнатова Людмила Казимиров-на. 142290 Московская обл., Пущино, ул. Институтская 2. Институт фундаментальных проблем биологии РАН. Факс: +7-(4967) 33-05-32; электронная почта: lkign@rambler.ru

т.е. или бикарбоната, или протона, или углекислого газа. Недостаточность логического подхода именно в случае фотосинтеза проявилась, когда экспрессия стромальной КА ф-КА1), количество которой в клетке уступает только РБФК/О, была подавлена более, чем на 95%, но не произошло ожидаемого уменьшения скорости фиксации СО2 [4]. Последняя происходит там же в строме хлоропласта С3-растений и требует именно СО2, тогда как при рН 7.8 почти 97% неорганического углерода находится в форме бикарбоната, и роль КА стромы предполагалась как обеспечивающая

быструю конверсию НСО- в СО2. Данные гено-мики, свидетельствующие о том, что даже в небольшом геноме арабидопсиса имеется 19 генов, кодирующих КА [5], дают основание предполагать, что роль этих ферментов в метаболизме высших фотосинтезирующих растений не должна быть незначительной. Анализ тех изменений, которые происходят в организме или в конкретном процессе при нокауте гена какого-либо фермента, т.е. при полном отсутствии его экспрессии,

особенно важен для выяснения роли этого фермента. При таком подходе показана роль Р-КА1 в защите высших растений от стресса [6], и авторы предположили участие этой КА в поставке СО2 для биосинтеза жирных кислот, в частности жас-моновой, активирующей ряд генов защиты [7].

Цель нашей работы состояла в выявлении роли в процессе фотосинтеза а-карбоангидразы 4 (а-КА4) (по номенклатуре, использованной в работе [5] и применяемой большинством авторов), которая с помощью масс-спектрометриче-ского анализа была обнаружена среди белков ти-лакоидной мембраны [8, 9]. Расположение данного фермента в хлоропласте давало основание предполагать, что он может играть важную роль в метаболизме пластиды. В работе обнаружены различия некоторых морфологических характеристик и показателей, характеризующих фотосинтез, растений Arabidopsis thaliana (Columbia) дикого типа (ДТ) и двух линий мутантов с нокаутированным геном, кодирующим а-КА4. Высказано предположение о роли, которую играет а-КА4 в функционировании фотосинтетического аппарата растений.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Растения Arabidopsis thaliana экотипа Columbia (ДТ) и растения, нокаутированные по гену At4g20990, кодирующему а-КА4 (гомозиготные линии 9-12 и 8-8, полученные из линий SALK_117962 и SALK_024517C соответственно; семена были любезно предоставлены проф. J.V. Moroney, Louisiana State University, США), выращивали при 8-часовом освещении (150 мкмоль квантов/(м2 с)), температуре 19°С и концентрации CO2 450 ppm. Эксперименты проводили через 62—70 дней после посева семян.

Экстракты РНК выделяли с помощью набора реагентов Aurum total RNA Mini Kit ("BioRad", США) из листьев растений, предварительно замороженных в жидком азоте. Концентрацию РНК определяли спектрофотометрически при длине волны 260 нм, а затем проводили обратную транскрипцию с помощью набора реагентов iScript Reverse Transcription Supermix ("BioRad"). Полученная таким образом одноцепочечная кДНК и специфические праймеры к гену At4g20990, кодирующему а-КА4 (прямой 5'-TC-CTCACCAAGCTACTAAATGGAATAAA-3' и обратный 5'-TTGACGACAGTCCAAATGACGC-3'), были использованы при проведении количественной ПЦР (кПЦР) на приборе iQ5 BioRad с реактивами фирмы "Evrogen" (Россия). Анализ проводили в трех биологических повторностях. В качестве положительного контроля использовали прайме-ры к гену актина 7 At5g09810 (прямой 5'-GAAG-

GCTGGTTTTGCTGGTGAT-3' и обратный 5'-CCATGTCATCCCAGTTACTTACAATACC-3').

Определение содержания крахмала проводили путем измерения оптической плотности при 620 нм водных экстрактов листьев после добавки KI [10]. Для электронной микроскопии кусочки листьев фиксировали в 2% глутаровом альдегиде в фосфатном буфере (рН 7.4) с постфиксацией в 1% четырехокиси осмия. Дальнейшие процедуры проводили, как описано ранее [11].

Измерения флуоресценции хлорофилла a (Хл a) неотделенных листьев проводили с помощью флуориметра Mini-PAM ("Walz", Германия). Перед измерениями растения выдерживали 30 мин в темноте. Листья помещали в камеру-прищепку, где поддерживали требуемую концентрацию СО2. После включения низкоинтенсивного модулированного света регистрировали величину выхода флуоресценции F0, затем подавали импульс насыщающего света, после чего листья освещали белым светом лампы флуориметра (интенсивность 500 мкмоль квантов ФАР/(м2 с)). Измерения проводили в диапазоне длин волн 400—700 нм с помощью LI-190SA Quantum Sensor. В конце периода освещения (5—7 мин до достижения стационарного уровня флуоресценции) вновь подавали импульс насыщающего света. При этом автоматически происходило вычисление (1) эффективного квантового выхода ФС II (Y), характеризующего поставку электронов от ФС II в ЭТЦ при стационарном освещении; (2) коэффициента фотохимического тушения флуоресценции Хл a (qP), показывающего долю открытых реакционных центров ФС II; (3) величины NPQ, нефотохимического тушения флуоресценции, отражающего "недопоставку" энергии возбуждения молекул пигментов реакционному центру [12]. Последняя выражает тушение Штерна-Фольме-ра и рассматривается как прямо пропорциональное концентрации тушителя [13, 14].

Указанные показатели вычисляли по формулам: Y = (Fm - i^/Fm [15], qP = F - Fs)/(Fm - F0)

и NPQ = (Fm - Fm)/Fm, где Fm - максимальная величина выхода флуоресценции Хл a в адаптированных к темноте листьях в ответ на вспышку сильного света, Fs - выход флуоресценции при

стационарном освещении, F^a - максимальная величина выхода флуоресценции в ответ на вспышку сильного света в условиях освещения.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Уровень экспрессии гена At4g20990, кодирующего а-КА4, в листьях растений арабидопсиса относительно невелик. В сопоставимых единицах он ниже экспрессии гена At3g01500, кодирующе-

0.18 г

д

е

н.

т

о

,0

9

9

0 <N 0.12

f

At

а

н

е

г

в

о

т

п

и

р

к

с

н а 0.06

р

т

ь

н

е

в

о

р

Ур

0 —---

150 750

[CO2], ppm

Рис. 1. Влияние концентрации СО2 в воздухе при выращивании растений на уровень экспрессии гена At4g20990, кодирующего а-КА4.

го самую обильную КА растительной клетки (Р-КА1) примерно на 2 порядка (Н.Н. Руденко, не опубликовано). Экспрессия гена At4g20990 в листьях растений 20-25-дневного возраста, выращенных при концентрации СО2 в воздухе 750 ppm, была примерно в 3 раза выше, чем при 150 ppm (рис. 1), что свидетельствовало о том, что функционирование этой КА, находящейся в хлоропла-

Таблица 1. Вес надземной части и содержание крахмала в листьях растений Arabidopsis thaliana (Columbia) дикого типа и растений, нокаутированных по гену At4g20990, кодирующему а-КА4 (линии 9-12 и 8-8)

Растение Вес, % Содержание крахмала, мг/г сырого веса

ДТ 100 5.6 ± 0.4

9-12 114 9.4 ± 0.6

8-8 106 14.2 ± 0.8

Примечание. Цифры в таблице — средние из не менее, чем четырех биологических повторностей; плюс/минус в таблице — стандартная ошибка.

сте, действительно связано с процессом фотосинтеза, скорость которого выше при более высокой концентрации СО2 в воздухе во время вегетации [16]. Экспрессия этого гена возрастала и при увеличении освещенности растений (не показано), что можно рассматривать как подтверждение наличия такой связи.

Обе линии мутантных растений арабидопсиса, выращенные в одинаковых условиях с растениями ДТ, имели несколько больший размер листьев и, соответственно, большую розетку (рис. 2а). Измерения веса надземной части растения показали, что в мутантных растениях он выше, чем в растениях ДТ в среднем на 10% (табл. 1). Ярким отличием мутантов от ДТ оказалось резко у

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком