НЕЙРОХИМИЯ, 2013, том 30, № 2, с. 135-141
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 616.858:615.214
ВЛИЯНИЕ НООТРОПНЫХ ПРЕПАРАТОВ НА МЕТАБОТРОПНЫЕ ГЛУТАМАТНЫЕ РЕЦЕПТОРЫ МОЗГА
МЫШЕЙ BALB/c И С57BL/6
© 2013 г. Е. В. Васильева1, Ю. А. Золотарёв2, Г. И. Ковалёв1, *
1ФГБУ "НИИфармакологии имени В.В. Закусова" РАМН, Москва 2Институт молекулярной генетики РАН, Москва
В работе изучено влияние субхронического введения различных ноотропных препаратов (пираце-тама, фенотропила, ноопепта, семакса, пантогама, нооглютила) на нейрохимические характеристики метаботропных глутаматных рецепторов ш01иЫ1 в мозге мышей инбредных линий ВЛЬВ/е и С57ВЬ/6, которые различаются по исходным показателям исследовательского поведения, тревожности и двигательной активности. Обнаружено, что в мозге мышей С57ВЬ/6 величина Вшах оказалась выше, чем у ВЛЬВ/е, на 15—20%. 5-кратное введение препаратов в эквипотенциальных по но-отропному эффекту дозах не сказывалось на величинах Вшах во всех опытных группах мышей ВЛЬВ/е, тогда как введение мышам С57ВЬ/6 пирацетама, ноопепта и семакса приводило к снижению плотности мест связывания [3Ы]-ЬУ354740 на 21, 19 и 18% соответственно. Пантогам и но-оглютил не влияли на связывание с ш01иЫ1, что предполагает наличие у них особого спектра но-отропного действия.
Ключевые слова: BALB/c, C57BL/6, пирацетам, фенотропил, ноопепт, семакс, пантогам, нооглютил, ноотропное действие, глутамат, фронтальная кора, mGluR, [3HJ-LY354740.
Б01: 10.7868/81027813313020088
ВВЕДЕНИЕ
Известно, что в реализации эффектов ноотропных препаратов значительную роль играет глута-матергическая нейромедиаторная система, которая активно вовлечена в процессы синаптической пластичности и долговременной потенциации. В предыдущих исследованиях с использованием [3Ы]-дизоцилпина, лиганда канального сайта ММЭЛ-рецептора нами было установлено, что ММЭЛ-рецептор участвует в процессах нормализации пластической функции мозга животных под воздействием субхронического системного введения ноотропных препаратов различного строения [1]. Вместе с тем роль других типов глутаматных рецепторов — АМРА, каинатных, метаботропных — в фармакологических эффектах ноотропных препаратов остается неопределенной. В частности, ме-таботропные глутаматные рецепторы (шС1иЯ) вовлечены в выполнение ряда важнейших функций в центральной и периферической нервных системах — в процессах памяти, обучения, ощущении тревоги, восприятии боли [2, 3]. Однако возможность их участия в механизме действия но-
* Адресат для корреспонденции: 125315 Москва, ул. Балтийская, 8, тел. (495) 601-20-51; e-mail: geo-kovalev@yandex.ru.
отропных препаратов до настоящего момента не изучена.
Ранее нами в экспериментах по радиолиганд-ному анализу in vitro обнаружено сродство но-отропного препарата семакс к mGluR типу глутаматных рецепторов мозга: данный гептапеп-тид в умеренной степени конкурировал с [3H]-LY354740 за mGluRII-рецепторы с величиной IC50 = 33 ± 2.4 мкМ, тогда как другие но-отропы (пирацетам, фенотропил, пантогам, нооглютил) оказались неэффективными [4].
Кроме того, ноотропные препараты проявляли свою специфическую активность лишь в отношении субпопуляции аутбредных мышей 1CR с исходно низкой эффективностью исследовательского поведения в лабиринте [1]. Аналогичные данные были получены в отношении инбредной линии мышей BALB/c, характеризующейся по сравнению с мышами линии C57BL/6 меньшей эффективностью исследовательского поведения и большей тревожностью в условиях незнакомой обстановки [5].
Таким образом, целью данной работы стало изучение влияния ноотропных препаратов различной химической структуры на характеристики ме-таботропных глутаматных рецепторов mGluRII в мозге мышей инбредных линий BALB/c и C57BL/6
после субхронического введения в дозах, эквипотенциальных по антиамнестическому эффекту.
МЕТОДИКА
Животные. Исследования проводили на самцах мышей линий BALB/c и C57BL/6 массой 25— 30 г, которых содержали в виварии ФГБУ "НИИ фармакологии имени В.В. Закусова" РАМН в стандартных условиях со свободным доступом к воде и корму ad libitum, по 15 особей в клетке в течение 1-й нед до начала эксперимента, на стандартной диете при 12 часовом световом режиме. Животным посредством внутрибрюшинных инъекций в течение 5 дней (субхроническое введение) один раз в сутки вводили физиологический раствор (контрольная группа — NaCl, 0.9%), либо препараты, растворенные в физиологическом растворе (опытные группы).
В эксперименте использовались следующие дозы препаратов: пирацетам — 200 мг/кг/день (UCB); фенотропил — 100 мг/кг/день (Валента Фарм), пантогам - 200 мг/кг/день (ПИК-ФАРМА), семакс - 0.6 мг/кг/день (ОХФАВ ИМГ РАН), но-оглютил — 50 мг/кг/день и ноопепт — 1 мг/кг/день (синтезированы в ФГБУ "НИИ фармакологии имени В.В. Закусова" РАМН). Препараты применяли в дозах, эквипотенциальных по антиамне-стическому эффекту в тесте УРПИ и в экспериментах по микродиализу [6].
После декапитирования мышей головной мозг извлекали на льду и выделяли фронтальную кору по общепринятой схеме [7].
Радиоактивные лиганды рецепторов. При изучении рецепторного связывания использовали лиганд глутаматных метаботропных рецепторов [3H]-LY354740 (22 Кюри/ммоль), который был получен проф. Ю.А. Золотаревым методом твердофазного катализа в ОХФАВ ИМГ РАН (зав. — академик РАН Н.Ф. Мясоедов). Выбор лиганда осуществляли в соответствии с рекомендациями IUPHAR (2006).
Субклеточное фракционирование. Выделение mGluR рецепторов проводили по методу [8]. Кору гомогенизировали в 25 объемах буфера № 1 (50 mM Tris-HCl, pH 7.1). Гомогенат центрифугировали при 48000 g 10 мин. Полученный осадок гомогенизировали и гомогенат инкубировали при 37°С 10 мин, затем центрифугировали при 48 000 g 10 мин. Осадок ресуспендировали и замораживали при —80°С. В день эксперимента мембраны размораживали и центрифугировали 3 раза в буфере № 2 (50 mM Tris-HCl, 2 mM MgCl2, pH 7.4) 48000 g 10 мин. Реакционную смесь инкубировали 1 ч при комнатной температуре. Концентрация белка в образцах мембран составляла 0.25 мг/мл.
После инкубации реакционную смесь пропускали через фильтры GF/С (Whatman), предварительно смоченные в 0.3% полиэтиленимине. Каждую пробирку промывали два раза холодным буфером № 2, затем фильтры промывали два раза тем же объемом буфера. Фильтры заливали 5 мл сцинтилляционной жидкости на основе толуола (4 г PPO, 0.2 г POPOP на 1 л толуола). Радиоактивность определяли на счетчике Tri-Carb 2900TR (Perkin Elmer) с эффективностью счета 42—46%.
Радиолигандный анализ. Реакционная смесь (конечный объем 0.5 мл) содержала 200 мкл буфера, 50 мкл [3H]-LY354740 в диапазоне концентраций от 1.56 до 200 нМ и 200 мкл суспензии мембран ткани мозга. Неспецифическое связывание определяли в присутствии 50 мкл глутамата (1 mM). Специфическое связывание рассчитывали как разницу между общим и неспецифическим связыванием.
Обработка и представление результатов. Результаты экспериментов ex vivo оценивали с помощью рассчитанных величин Kd и Bmax, отражающих степень сродства рецептора к лиганду (нМ) и количество мест связывания лиганда (фмоль/мг белка), соответственно. Для построения кривых вытеснения радиоактивных лигандов каждая концентрация меченого лиганда была взята в 2 повторностях. Для обработки результатов ра-диолигандного связывания использовали программу GraphPad Prism 4 Demo и Statistica 6.0. Результаты представлены в виде "mean ± S.E.M".
РЕЗУЛЬТАТЫ
Графики насыщения глутаматных метаботроп-ных рецепторов мозга мышей BALB/c и C57BL/6 под влиянием ноотропных препаратов, а также результаты их преобразования по Скетчарду представлены на рис. 1—3. Рассчитанные величины характеристик рецепторного связывания Kd и Bmax для данных групп животных — в таблице.
Обнаружено, что величины Kd в мембранах коры не различаются между контрольными группами двух линий мышей BALB/c и C57BL/6. Более того, этот показатель оставался неизмененным и под влиянием субхронического введения препаратов. Напротив, величины плотности рецепторов Bmax между контрольными группами показали наличие межлинейных различий в пределах 17— 27% в пользу линии C57BL/6.
Под воздействием ноотропов в группах мышей BALB/c эффектов в отношении Bmax для [3H]-LY354740 не было обнаружено. В группах мышей C57BL/6 после введения пирацетама, но-опепта и семакса количество мест связывания уменьшалось на 21, 19 и 18%, соответственно: Bmax для пирацетама 880 ± 62 фмоль/мг против
1000 -
-•- Контроль О Пирацетам ■ ■■ Фенотропил
ь л о
0 7
in
3
е и н а
й 3
m «
m U
500
• Контроль О Пирацетам ■ Фенотропил
50
400 600 800 1000 Bound, fmol/mg J_l_
100 150 200
Концентрация [3H]-LY 354740, нМ б
1000 -
ь л о
0 4 7
4
5 3
е и н а
й 3
m
я
m U
500
50
100
150
200
Концентрация [3H]-LY 354740, нМ
Рис. 1. Влияние пирацетама и фенотропила на связывание [3H]-LY354740 с метаботропными глутаматными рецепторами коры мышей BALB/c (а) и C57BL/6 (б) (кривая насыщения и график Скетчарда). * отличия от контроля (t-test).
статистически значимые
а
0
0
1117 ± 118 фмоль/мг в контроле; а Bmax для ноопепта 981 ± 74 фмоль/мг и для семакса 986 ± ± 79 фмоль/мг по сравнению с Bmax 1208 ± ± 94 фмоль/мг в контрольной группе.
Препараты фенотропил, пантогам и нооглю-тил не изменяли числа мест связывания для изучаемого лиганда mGluR-рецепторов.
ОБСУЖДЕНИЕ
Метаботропные глутаматные рецепторы (шС1иЯ) выполняют важные функции в центральной и периферической нервных системах: участвуют в процессах памяти, обучения, ощущении тревоги, восприятии боли. Эти рецепторы обнаружены на мембранах как пре-, так и постси-
о
3
о
и
Я
св
э
3
т «
<ч
С
о
3
о
и
Я
св
э
3
т «
<ч
С
1000 -
500 -
50
1000
500
50
100
150
200
Концентрация [3Ы]-ЬУ 354740, нМ
100 150 200
Концентрация [3Ы]-ЬУ 354740, нМ
Рис. 2. Влияние ноопепта и семакса на связывание [3Ы]-ЬУ354740 с метаботропными глутаматными рецепторами коры мышей БЛЬБ/е (а) и С57БЬ/6 (б) (кривая насыщения и график Скетчарда). * — статистически значимые отличия от контроля (Ме81;).
0
0
наптических нейронов гиппокампа, мозжечка и коры, а также в других областях мозга [2].
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.