НЕИРОХИМИЯ, 2007, том 24, № 1, с. 37-40
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 599-576.72.616
ВЛИЯНИЕ ОБОГАЩЕННОГО ПРОЛИНОМ ПОЛИПЕПТИДА НА ВОССТАНОВЛЕНИЕ МЕТГЕМОГЛОБИНА
И ОБРАЗОВАНИЕ СУПЕРОКСИДА ПОД ДЕЙСТВИЕМ МЕТАЛЛОПРОТЕИНОВ -ЦИТОХРОМА b558III И СУПРОЛА IN VITRO
© 2007 г. Г. М. Симонян, Р. М. Симонян, Г. Р. Агамян, М. А. Симонян, А. А. Галоян*
Институт биохимии им. Г.Х. Бунятяна НАН РА
Показано, что синтетический аналог обогащенного пролином полипептида (ПП-1) из нейросекре-торных гранул нейрогипофиза быка (1.5-7 мкг/мл) стимулирует восстановление метгемоглобина (метНЬ) и NADPH-зависимое образование супероксида под действием цитохрома (цит) b558III из мембран эритроцитов человека в процессе инкубации в аэробных условиях при 4° in vitro. Однако увеличение концентрации ПП-1 вызывало снижение супероксидпродуцирующей активности цит b558III. Показано также, что ПП-1 вызывает торможение образования супероксида под влиянием липопротеина сыворотки крови - супрола.
Ключевые слова: обогащенный пролином полипептид, цитохром b558III, метгемоглобин, восстановление, супероксид, супрол.
Открытие A.A. Галояном и сотр. нового класса кардиоактивных и иммуномодуляторных ней-рогормонов, продуцируемых нейросекреторны-ми клетками гипоталамуса животных и человека, коренным образом меняет представление о функциональном значении нейросекреции гипотала-мических ядер не только в регуляции гипоталамусом функций эндокринных желез с участием ри-лизинг-гормонов, но и в механизмах адаптации организма к изменениям внешней среды. Из ней-росекреторных гранул нейрогипофиза, наряду с вазопрессином и окситоцином, были выделены 4 обогащенных пролином полипептида (ПП), первичная структура которых соответствут С-концевой аминокислотной последовательности предшественника вазопрессин-нейрофизин-2-гли-копептида. Один из них, ПП-1 (галармин), состоящий из 15 аминокислотных остатков (Ala-Gly-Ala-Pro-Glu-Pro-Ala-Glu-Pro-Ala-Gln-Pro-Gly-Val-Tyr), обладает антибактериальными, антивирусными, нейропротекторными и иммуномодулятор-ными свойствами. Этот полипептид регулирует рост и дифференцировку тимоцитов в эмбриональный и постэмбриональный периоды развития. ПП-1 обладает мощной метаболической активностью, оказывая регулирующее влияние на активности фосфолипазы A2 и каспаз при различных патологических состояниях организма, на пе-рекисное окисление липидов, обмен фосфолипи-дов, утилизацию глюкозы, биосинтез белков [1, 2].
* Адресат для корреспонденции: 375014, Ереван, ул. П. Севака, 5/1; тел.: 28-18-40; e-mail: galoyan@sci.am
ПП-1 оказывает регулирующее воздействие на уровень эндогенных металлопротеинов, обусловливающих антиоксидантную и прооксидантную активности крови при злокачественных новообразованиях [3], алюминиевой интоксикации [4], интоксикации тяжелыми металлами [5], гипогликемии [6], гемисекции спинного мозга. ПП-1 стабилизирует эритроцитарные мембраны (ЭМ) путем подавления высвобождения цит Ь558Ш из этих мембран [7], регулирует миелопоез [2].
По предварительным данным, ПП-1 оказывает и антиоксидантный эффект путем "улавливания" высокоактивных гидроксильных радикалов. В подавляющем большинстве патологических состояний различного характера у млекопитающих, включая человека, наблюдается анемия и увеличение уровня метНЬ, не способного перенести молекулярный кислород к клеткам [8]. В этих условиях положительный эффект ПП-1, возможно, проявляется в улучшении гомеостаза кислорода.
В последнее десятилетие обнаружены новые типы металлопротеинов из ЭМ и сыворотки крови, обладающие прооксидантной активностью (МПА) [9, 10]. Предположена их биологическая роль как NADPH-зависимыx супероксидпродуци-рующих гемопротеинов, среди которых цит Ь558Ш обладает метНЬ-восстанавливающей активностью [11, 12]. В связи с этим представляется целесообразным изучение влияния ПП-1 на активность МПА как факторов регуляции гомеостаза кислорода, в частности МПА нового типа -
550 565 нм
555 нм
0.8
0.4
0
Рис. 1. Изменение формы спектра метНЬ (1) из эритроцитов человека в присутствии цит Ь558Ш из ЭМ человека и ПП-1. После преинкубации цит Ь558Ш (с А530 = 0.03) с ПП-1 при 4° в течение суток в реакционную смесь добавляли 3 мл метНЬ и определяли кинетику снижения МетНЬ в течение 5-6 ч при 30°. Снижение уровня максимального оптического поглощения альфа-полосы метНЬ (заштрихованная часть спектра) (1) в присутствии ПП-1 в количестве 1,5 (2), 3 (3), 6 (4) и 8 мкг/мл (5); после добавления к (1) дитио-нита натрия (6) и в присутствии только цит Ь558Ш (7).
супероксидпродуцирующего липопротеина сыворотки - супрола как фактора поддержания нормальной вязкости сыворотки и гемодинамики в целом [10].
Целью работы является определение NADPH-зависимой супероксидпродуцирующей и метНЬ-восстанавливающей активности ключевой изо-формы цитохромов b558 из ЭМ - цит b558III, а также супероксидпродуцирующей активности супрола в присутствии различных концентраций ПП-1 in vitro.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
МетНЬ из эритроцитов человека выделяли и очищали до электрофоретически гомогенного состояния с использованием ионообменной хроматографии на целлюлозе КМ-52 ("Whatman", Англия) и сефадексе КМ С-50 с последующей гель-фильтрацией на сефадексе G-75 ("Pharmacia", Швеция).
Цит b558III был выделен из ЭМ в электрофоретически гомогенном состоянии; супрол из сыворотки донорской крови человека был получен биотехнологическим методом с чистотой 98% [13]. Выделение цит b558III из ЭМ проводили без использования детергента в качестве солюбили-зирующего средства, так как детергент неблагоприятно влияет на его стабильность [14].
Супероксидпродуцирующую активность цит b558III и супрола определяли с использованием
нитротетразолиевого синего (НТС) путем вычисления процента формазана (при 560 нм) при восстановлении НТС супероксидными радикалами
(О-) [5]. За единицу 02 -продуцирующей активности супрола или цит Ъ558Ш принимали количество белка, способного повышать уровень формазана на 50%.
МетНЪ-восстанавливающая активность цит Ъ558111 была определена путем измерения снижения величины оптического поглощения альфа-полосы метНЪ (ферриНЪ) при 565 нм в течение 56 ч при 30° [12] в отсутствие и в присутствии определенного количества синтетического препарата ПП-1. Были использованы концентрации стерилизованного препарата ПП-1 в диапазоне от 1.5 до 10 мкг/мл. За единицу метНЪ-восстанавливаю-щей активности цит Ъ558Ш принимали количество гемопротеина, снижающего уровень поглощения альфа-полосы (заштрихованная часть спектра на рис. 1) на 0.05 оптической единицы в течение часа при 30°. Пробы, содержащие цит Ъ558Ш, преинкубировали с указанными концентрациями ПП-1 (см. рис. 1) в течение суток при 4°, а затем непосредственно в кварцевые кюветы спектрофотометра добавляли 3 мл метНЪ.
Снижение максимального оптического поглощения альфа-полосы метНЪ (при 565 нм) было прямо пропорционально увеличению максимального оптического поглощения Fe+2-Нb при 555 нм. Измерения оптических спектров осуществляли на спектрофотометре '^ресогё ЦУ-УК" (Германия).
Статистическую обработку полученных результатов осуществляли методом вариационной статистики Стьюдента-Фишера с определением критерия достоверности (р).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Инкубация ПП-1 с цит Ъ558Ш при 4° в течение суток с последующим добавлением к реакционной смеси метНЪ вызывает концентрационно-за-висимое увеличение уровня ферроНЪ или уменьшение альфа-полосы метНЪ через 6-8 ч при 30° (рис. 1). В отличие от цит Ъ558Ш, который в приведенных условиях восстанавливает ферриНЪ (метНЪ) в течение 6-8 ч (рис. 1, кривая 5), классический восстановитель дитионит натрия (1 мг) вызывает мгновенное восстановление ферриНЪ до ферроНЪ (рис. 1, кривая 6). Нелинейный характер снижения оптической плотности образца в зоне альфа-полосы свидетельствует о сложном механизме стимуляции восстановления метНЪ в присутствии ПП-1 (рис. 2). Процесс восстановления метНЪ в аэробных условиях носит обратимый характер: после аэрации, вызванной легким перемешиванием реакционной смеси, происходит окисление ферроНЪ до ферриНЪ (метНЪ). Поэто-
3
ВЛИЯНИЕ ОБОГАЩЕННОГО ПРОЛИНОМ ПОЛИПЕПТИДА
39
му процесс осуществляется непосредственно в кварцевых кюветах спектрофотометра без перемешивания реакционной смеси.
Механизм действия ПП-1 пока трудно определить, хотя нельзя исключить, что ПП-1 стимулирует процесс переноса электрона от группы ФАД в составе цит Ь558Ш к Fe+3 гемовой группы этого гемопротеина, далее к N0 в лигандном окружении железа и, наконец, к Fe+3-метHb, восстанавливая его до ферроНЬ. Высказано предположение, что за счет N0 в лигандном окружении цит Ь558Ш образуется нестабильное комплексное соединение с метНЬ [15]. Действительно, N0 присоединяется к железу гемоглобина и образует нитрозилгемоглобин [16]. Это явление характерно для многих заболеваний (в частности канцерогенез), при которых наблюдается нарушение микроструктуры ЭМ с резким увеличением проникновения в них метНЬ [15]. За счет этого происходит "покраснение" ЭМ, которое сохраняется при обычном промывании калий-фосфатным буфером (рН 7.4), но исчезает при ионообменной хроматографии [15].
Не исключена возможность, что ПП-1 может соединяться с соответствующим участком молекулы цит Ь558Ш. Действительно, изоформы фла-воцитохрома Ь558, локализованные в фагоцитирующих лейкоцитах и являющиеся важным компонентом в составе NADPH-зависимыx оксидаз, содержат в субъединицах ПП [17]. Отметим, что цит Ь558Ш ЭМ также является флавинсодержа-щим гемопротеином, отличающимся высоким удельным содержанием, по сравнению с флавоци-тохромами иммунных клеток. Эффект стимулирования под действием ПП-1 процесса восстановления цитохромом Ь558Ш метНЬ в гомогенной фазе - несомненно, положительное явление, поскольку при различных проявлениях анемии [8] уровень метНЬ увеличивается на 20-25% (физиологический уровень метНЬ в эритроцитах не превышает 3%).
Наряду с увеличением метНЬ-восстанавлива-ющей активности цит Ь558Ш ПП-1 при сравнительно низких концентрациях стимулирует и
NADPH-зависимую 0- -продуцирующую активность этого гемопротеина, однако подавляет ее при повышенных концентрациях (рис. 3). Мех
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.