научная статья по теме ВЛИЯНИЕ ПАРЦИАЛЬНОГО ДАВЛЕНИЯ КИСЛОРОДА НА ВЫЖИВАЕМОСТЬ, ПРОЛИФЕРАЦИЮ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКУ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ИЗ КОСТНОГО МОЗГА МЫШИ Биология

Текст научной статьи на тему «ВЛИЯНИЕ ПАРЦИАЛЬНОГО ДАВЛЕНИЯ КИСЛОРОДА НА ВЫЖИВАЕМОСТЬ, ПРОЛИФЕРАЦИЮ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКУ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ИЗ КОСТНОГО МОЗГА МЫШИ»

БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2008, том 25, № 5, с. 352-359

УДК 576.312.6

ВЛИЯНИЕ ПАРЦИАЛЬНОГО ДАВЛЕНИЯ КИСЛОРОДА НА ВЫЖИВАЕМОСТЬ, ПРОЛИФЕРАЦИЮ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКУ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК

ИЗ КОСТНОГО МОЗГА МЫШИ

© 2008 г. Н. В. Панюхин, X. С. Вишнякова, Е. Е. Егоров

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгелъгардта РАН, 119991 Москва, ул. Вавилова, д. 32;

электронная почта: yegorov58@mail.ru Поступила в редакцию 01.04.2008 г.

Изучали влияние парциального давления кислорода в атмосфере, окружающей культуральную среду, на выживание, пролиферацию и дифференцировку мезенхимальных стволовых клеток (МСК) из костного мозга мыши. Показано, что в присутствии 3% кислорода увеличивается выживаемость клеток при редкой посадке, возрастает скорость их роста и продолжительность пролиферации. Влияние концентрации кислорода на пролиферацию значительно сказывается уже через несколько дней культивирования. Изучение колониеобразования МСК при различном уровне кислорода показало, что даже преинкубация в условиях 21% кислорода отрицательно сказывается на дальнейшем росте клеток при 3% кислорода, а выращивание клеток при 3% кислорода благотворно для их пролиферации в присутствии 21% кислорода. При этом нельзя однозначно говорить о вредном воздействии атмосферного кислорода. Оказалось, что сниженное парциальное давление кислорода тормозит остеогеннную дифференцировку МСК, но не выявлено достоверного влияния содержания кислорода на адипогенную дифференцировку. Таким образом, уровень кислорода в среде способен влиять не только на их пролиферацию, но и на эффективность дифференцировки клеток.

Кислород является основным элементом человеческого тела (более 62% веса). Кроме того, кислород является и самым потребляемым и быстро-оборачивающимся элементом. Организм ежесекундно посредством своих специализированных клеток измеряет содержание кислорода во вдыхаемом воздухе и в артериальной крови и подстраивает свои функции для поддержания его нормального потребления. Расширяются и сужаются сосуды в разных частях тела, расширяются и сужаются бронхи, меняется работа сердца и центров головного мозга, начинают и прекращают размножаться клетки-предшественники эритроцитов, сокращаются и расслабляются дыхательные мышцы. Однако при культивировании клеток вопрос о концентрации кислорода в культуральной среде до последнего времени практически игнорировался.

Уже относительно давно было замечено, что культивирование клеток при пониженном содержании кислорода в среде увеличивает их пролифера-тивный потенциал [1]. Подобный результат объясняли уменьшением окислительного повреждения клеток в условиях относительной гипоксии. После возникновения теломерной теории старения появились работы, указывающие на то, что теломеры обладают повышенной по сравнению со всем геномом чувствительностью к окислительному повреждению. Показано, что повышение содержания кислорода способно приводить к быстрой потере

теломерной ДНК (до 500 п.н. за одно деление клетки) и вызывать тем самым преждевременное старение клеток [2, 3].

Однако снижение уровня кислорода в среде, несмотря на вызываемое им увеличение пролифера-тивного потенциала клеток, довольно слабо влияет на величину потерь теломерной ДНК. Проли-феративный потенциал возрастает в основном за счет того, что старение клеток в этих условиях наступает при более коротких теломерах [4]. Более того, многие опыты показывают, что в условиях гипоксии в клетках возрастает концентрация активных форм кислорода (АФК) (супероксидных анионов и гидроксидных радикалов) [5-7]. Это парадоксальное явление нуждается в дальнейшем изучении.

Таким образом, на современном этапе не ясно, за счет чего гипоксия способна увеличивать про-лиферативный потенциал клеток и каким образом повышенная концентрация АФК в клетках приводит к уменьшению (пусть и незначительному) потерь теломерной ДНК.

Можно предположить, что увеличение проли-феративного потенциала клетки в условиях гипоксии обусловлено активацией ряда генов, в том числе гена каталитического компонента теломе-разы [4, 8]. Возможно, именно этим определяется способность гипоксии индуцировать пролиферацию покоящихся миогенных клеток [9].

По всей видимости, уровень кислорода во многом определяет судьбу дифференцирующейся клетки. Известно, что гипоксия предотвращает диффе-ренцировку эмбриональных стволовых клеток в культуре [10]. Распределение гемопоэтических стволовых клеток внутри костного мозга задается региональной гипоксией [11]. Циркулирующие в крови стволовые клетки направляются в очаги повреждения согласно градиентам гипоксии [12]. Гипоксия способна усиливать [13] или ослаблять остеогенную дифференцировку мезенхимальных стволовых клеток (МСК) [14, 15].

Клетки мыши в отличие от клеток человека имеют очень длинные теломеры, и механизм концевой недорепликации не может объяснить остановку их пролиферации в культуре. В последнее время (примерно с 2002 года) утвердилось мнение, что клетки мыши и других мелких грызунов претерпевают в культуре окислительный шок и именно этим объясняется остановка их пролиферации [16]. В 2003 году было показано, что именно концентрация растворенного в среде кислорода определяет пролиферативный потенциал фибробла-стов мыши в культуре [17].

МСК из костного мозга являются одними из наиболее доступных стволовых клеток, которые можно использовать в клеточной терапии. Мы поставили своей целью изучить влияние концентрации кислорода на пролиферацию и дифференци-ровку МСК мыши.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Клетки. МСК костного мозга получали от мышей линии C57B1/6. Самцов 8-10-недельного возраста забивали разрушением шейного отдела спинного мозга. Стерильно извлекали бедренные и большие берцовые кости, освобождали их от мягких тканей. Эпифизы полученных костей отделяли, а диафизы промывали ростовой средой, состоящей из DMEM ("ПанЭко"), содержащей 10% эмбриональной телячьей "характеризованной" сыворотки ("HyClone", США), 40 ед./мл гентамицина ("ПанЭко") и 12 мМ L-глутамина ("ПанЭко"). Выделенные из диафизов костей клетки помещали в конические пробирки, содержащие 5 мл ростовой среды, и центрифугировали в течение 10 мин при 400g. Осадок из каждой пробирки ресуспендирова-ли в ростовой среде и высевали в концентрации 106 клеток/мл в 75-см2 культуральные флаконы ("Costar", США). Через 48 ч не прикрепившиеся клетки удаляли, а во флаконы добавляли 20 мл свежей ростовой среды. Прикрепившиеся клетки культивировали, заменяя ростовую среду каждые 3-4 дня. По достижении монослоя клетки снимали с подложки с помощью 0.25% раствора трипсина ("ПанЭко") в смеси с раствором Версена ("ПанЭко") в соотношении 1 : 1. Осадок ресуспендировали в ростовой среде и высевали в концентрации 104 клеток/мл. Клетки

культивировали в специализированном С02-инку-баторе (модель 484, "ThermoForma", США) в атмосфере, содержащей 5% С02 и 3 или 21% кислорода. После четвертого пассажа к ростовой среде добавляли основной фактор роста фибробластов (bFGF, "Sigma", США) в концентрации 10 нг/мл.

Колониеобразование осуществляли, как описано в [18]. В пластиковые 10 см чашки Петри ("Costar") высевали по 200 клеток (подсчет проводили в камере Горяева) и культивировали в ростовой среде при 37°С в атмосфере, содержащей 5% С02, 3 или 21% кислорода. Через 6 дней клетки фиксировали и окрашивали (70% этанол, 0.1% метилено-вый синий).

Подсчитывали число колоний и количество клеток в колониях. Под колониями мы понимаем колонии любого размера, в том числе состоящие из одной клетки. Каждую чашку закрепляли на листе бумаги с нарисованной сеткой. Изображения анализировали с помощью стереомикроскопа МБС-9 (СССР). На листе бумаги с увеличенным изображением сетки отмечали положение колоний и количество клеток в них. Количество клеток считали округленно по разрядам двоичной системы. Например, если группа клеток состояла из трех или четырех клеток, то записывали 4, если в группе было от 5 до 8 клеток - 8, если от 129 до 256, то записывали 256.

Индукция клеточной дифференцировки. Для

индукции остеогенной дифференцировки к монослою клеток добавляли ростовую среду, содержащую: дексаметазон (0.1 мкМ), Р-глицерофосфат (10 мМ) и фосфат L-аскорбиновой кислоты (100 мкМ). Для адипогенной дифференцировки в среду добавляли: дексаметазон (1 мкМ), 3-изобу-тил-1-метилксантин (0.5 мМ) и инсулин (1 мкг/мл). Среду меняли каждые 3 дня. Через 7 и 10 дней для адипогенной и остеогенной дифференцировки, соответственно, клетки фиксировали раствором 4% формальдегида в фосфатном солевом буфере в течение 10 мин при комнатной температуре.

Гистохимическая обработка и фотографирование. Для выявления накопления липидов клетки окрашивали насыщенным раствором Судана 4 в 70% этаноле. Для выявления минерализованного матрикса клетки окрашивали при комнатной температуре в течение 10 мин 2% раствором Ализаринового красного, рН 4.1-4.3 [19]. Клетки фотографировали с помощью инвертированного фазово-контрастного микроскопа Diaphot ("Nikon", Япония) и цифровой камеры Nikon 70. Изображения контрастировали с помощью программы Image J. Клетки фотографировали во влажном состоянии сразу после окрашивания.

Рис. 1. МСК мыши через 2 мес культивирования. а - 3% кислорода, видны множественные митотические клетки; б - 21% кислорода, клетки крупные распластанные, митозов нет. Фазовый контраст, цифровое контрастирование.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Увеличение выживаемости мезенхимальных стволовых клеток (МСК) из костного мозга мышей при пониженном парциальном давлении кислорода. Предварительные опыты по изучению влияния парциального давления кислорода (2, 3, 5%) на рост колоний МСК мыши (результаты не показаны) не выявили достоверных различий, хотя худший (по скорости роста) результат получен при 5% кислорода. В дальнейшем было решено использовать 3% кислорода. Первые опыты по культивированию МСК мыши при пониженном содержании кислорода (3%) показали, что клетки лучше выживают в сравнительно гипоксических условиях. В опытах с различными количествами посаженных клеток и различной длительностью наблюдения (восемь опытов колониеобразования, по три чашки на точку) количество колоний, выросших при 3%

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком