ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 1, с. 92-101
УДК 581.1
ВЛИЯНИЕ ПОДАВЛЕНИЯ БИОСИНТЕЗА ЭТИЛЕНА НА СОЕДИНЕНИЯ, ОПРЕДЕЛЯЮЩИЕ ВКУСОВЫЕ КАЧЕСТВА
ПЛОДОВ ТОМАТА
© 2007 г. X. Я. Гао, Б. Ц. Чжу, X. Д. Чжу, Я. Л. Чжан, Я. X. Се, Я. Ч. Ли, Я. Б. Ло
Китайский сельскохозяйственный университет, Пекин, Китай Поступила в редакцию 16.01.2006 г.
Для выяснения роли этилена в образовании соединений, определяющих вкус и запах плодов томата, использовали растения дикого типа (Ьусорешсоп esculentum Ь., сорт Ы^ип) и трансгенной антисмысловой линии LeACS2 с подавленным биосинтезом этилена. Метаболизм индивидуальных сахаров не зависел от этилена, однако этилен регулировал содержание лимонной и яблочной кислот. Содержание этих кислот было выше в трансгенных растениях, но возвращалось к норме после обработки трансгенных плодов этиленом. Поскольку содержание большинства тех аминокислот, которые относятся к предшественникам ароматических летучих соединений, коррелировало с содержанием этилена, мы предположили, что этилен влияет на их образование и, следовательно, на запах плодов. Анализ летучих соединений показал, что при созревании плодов томата дикого типа накапливалось значительное количество альдегидов, в то время как образование большей части летучих соединений трансгенными плодами было резко подавлено. При ингибировании в них синтеза этилена снижалось образование гексанала, гексанола, транс-2-гептенала, цис-3-гексенола и летучих соединений, родственных каротиноидам, за исключением Р-дамасценона и Р-ионона. Трансгенные плоды не отличались от плодов дикого типа по концентрации цис-3-гексенала и транс-2-гексенала; очевидно, синтез этих соединений не зависел от этилена. Таким образом, этилен по-разному регулировал состав и соотношение соединений, определяющих вкус и запах плодов томата.
Lycopersicon esculentum - плоды томата - этилен - летучие соединения - вкус и аромат
ВВЕДЕНИЕ
Спелые плоды различаются по окраске, текстуре, запаху, вкусу и составу питательных веществ. Биохимическая и генетическая регуляция вкусовых качеств плодов в последнее время привлекает все больше внимания. Этилен - важный фитогормон климактерических плодов - инициирует и ускоряет процессы, связанные с созреванием, в том числе изменение окраски, текстуры и вкуса. Поэтому влияние этилена на вкусовые качества плодов заслуживает дальнейшего изучения. В последнее десятилетие появилось много исследований, характеризующих гены, кодирующие ферменты биосинтеза этилена [1, 2]; исследуется влияние этилена на транскрипцию и трансляцию многих генов, связанных с созреванием [3, 4]. АЦК-синтаза (АЦС) является ключевым фер-
Сокращения: АЦК - 1-аминоциклопропанкарбоновая кислота; АЦС - АЦК-синтаза; ДПЗ - дни после зацветания; ТФМЭ - твердофазная микроэкстракция. Адрес для корреспонденции: Dr. Yunbo Luo. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Qinghua Donglu 17, Beijing 100083, China. Fax: (8610) 627386479; e-mail: lyb@cau.edu.cn
ментом биосинтеза этилена. Подавление биосинтеза предшественника этилена - АЦК - может нарушать нормальное созревание плодов, включая деградацию хлорофилла, синтез каротинои-дов и солюбилизацию пектинов клеточной стенки; оно также может влиять на содержание летучих соединений и сахаров [5]. Эти данные позволяют предположить важную роль этилена в биосинтезе ароматических летучих веществ в климактерических плодах.
Томаты являются прекрасной моделью для изучения роли этилена в климактерическом поспевании плодов. По мере достижения полной спелости окраска плодов меняется от зеленой до красной, плоды размягчаются, их текстура также меняется, и они приобретают характерный вкус и аромат. В этой работе мы исследовали влияние этилена на приобретение плодами томата вкусовых качеств и аромата.
Вкусовые качества и аромат плодов определяются балансом сахаров, органических кислот, летучих соединений и свободных аминокислот [6]. Baldwin с соавт. [7] изучили изменения в составе сахаров и органических кислот при созревании плодов двух сортов томата и не нашли связи между синтезом этилена и содержанием этих соедине-
ний. Напротив, другие исследователи [8] показали, что метаболические превращения сахаров и органических кислот в плодах яблони зависят от этилена. Поэтому связь метаболизма сахаров, органических кислот и этилена в плодах томатов заслуживает изучения.
Ароматические летучие соединения в значительной степени определяют качество плодов для потребителей. Для плодов томата известно около 400 таких соединений, но только 30 из них присутствуют в концентрациях, превышающих 1 нл/л [9-11]. В данной работе мы изучали изменения основных летучих соединений плодов томата в ответ на этилен. В зависимости от происхождения эти соединения можно разделить на пять групп: 1) производные превращений липидов, такие как гексанал, цмс-3-гексенал, транс-2-гексенал и гек-санол; 2) соединения, связанные с метаболизмом каротиноидов (6-метил-5-гептен-2-он, 6-метил-5-гептен-2-ол и в-ионон); 3) соединения-производные аминокислот; 4) соединения терпеноидного типа и 5) соединения, связанные с образованием лигнина [12]. Считается, что этилен является посредником в регуляции метаболизма ароматических соединений при созревании плодов томата [13]. Однако в литературе нет прямых подтверждений этого предположения.
Для лучшего понимания роли этилена в формировании вкусовых качеств и аромата поспевающих плодов томата мы сравнили плоды растений дикого типа и трансгенных растений с подавленным синтезом этилена, оценив образование летучих ароматических соединений и содержание сахаров, органических кислот и свободных аминокислот.
МЕТОДИКА
Растительный материал и применяемые обработки. Трансгенные растения томата с подавленным биосинтезом этилена получали путем трансформации растений томата дикого типа (Lycoper-sicon esculentum L., сорт Lichun) вектором, экспрессирующим кДНК гена АЦС (LeACS2) в антисмысловой ориентации. Как трансформированные растения, так и растения дикого типа выращивали в оранжерее при 25/20°С, 70%-ной влажности воздуха и 14-часовом фотопериоде. Цветки помечали на стадии зацветания, и развитие плодов характеризовали по числу дней после зацветания (ДПЗ). Зеленые плоды на 40-й ДПЗ, содержавшие зрелые семена, считали зрелыми зелеными плодами. На 45-й ДПЗ появлялись первые признаки связанного с поспеванием побуре-ния плодов (так называемые breaker плоды, B). Последующие стадии созревания обозначали по числу дней после этой стадии. Плоды томатов дикого типа собирали на пяти стадиях развития: зрелые зеленые (green, G), побуревшие (B), B + 3 дня
(желтеющие), B + 7 дней (розовые) и B + 10 дней (красные, спелые). Поскольку плоды трансгенных томатов поспевали медленнее, их собирали вплоть до стадии полной спелости (B + 40 дней). К этому сроку плоды дикого типа уже испортились.
Для обработки этиленом собирали зрелые зеленые плоды трансформированных и нетранс-формированных растений и помещали их в герметически закрытые сосуды с 100 мкл/л этилена вплоть до достижения спелости (до появления более 90% красных плодов).
Приготовление образцов для химического анализа. Мякоть плодов томата, собранных на каждой из стадий развития, измельчали в кухонном блендере в течение 30 с. Измельченную ткань выдерживали 3 мин для достижения максимальной концентрации цмс-3-гексенала [14]. Отделяли аликвоту гомогената (40 г), а остальной материал помещали в застегивающиеся на молнию пластиковые мешки и хранили при -80°С для последующего анализа сахаров, органических кислот и аминокислот. К 40 г гомогената добавляли 10 мл насыщенного раствора хлорида кальция, и смесь измельчали в блендере 10 с. Затем полученный гомогенат, используемый для анализа летучих соединений, разливали по сосудикам, мгновенно замораживали в жидком азоте и хранили при -80°С вплоть до анализа.
Анализ выделения этилена и дыхания. По мере достижения спелости плоды томата взвешивали, помещали в герметически закрывающиеся сосуды при 22°С и инкубировали 60 мин для накопления этилена и СО2. Пробу газа (1 мл) отбирали шприцем из самой верхней части сосуда и анализировали в GC-14C газовом хроматографе ("Shi-madzu", Япония), снабженном Propak S (80/100 меш.) и Carboplot колонками из нержавеющей стали, соединенными с детекторами пламенной ионизации и теплопроводности, соответственно. При определении этилена температура инжектора, колонки и детектора была соответственно 120, 60 и 150°С. При определении СО2 анализ проводили изотермально при 100°С, в то время как температура инжектора и детектора была 80 и 200°С. Содержание газов определяли путем сравнения времени удерживания и площади пиков с соответствующими параметрами стандартных соединений. Опыты повторяли трижды.
Анализ сахаров и органических кислот. Индивидуальные сахара и органические кислоты определяли методом Baldwin [7]. Замороженные образцы оттаивали в потоке водопроводной воды. Аликвоту гомогената (30 мл) экстрагировали 80%-ным этанолом. Экстракт пропускали через C-18 SepPak колонку ("Waters", США) и 0.45 мкм фильтр ("Millipore", Великобритания). Профильтрованный экстракт вводили в HP1050 HPLC систему ("Hewlett-Packard", США). Сахара анализи-
ровали с использованием C-18 SepPak колонки ("Waters") при 90°С и 0.1 мМ ЭДТА (динатриевая-кальциевая соль), используемого в качестве мобильной фазы, при скорости тока 2 мл/мин. Органические кислоты разделяли в колонке Ion-300 ("Interaction", США) при 65°С и 0.8 М H2SO4, примененной в качестве мобильной фазы, при скорости потока 0.4 мл/мин. Для измерения сахаров и органических кислот использовали рефрактометр и спектрофотометр при 210 нм, соответственно.
Анализ летучих соединений. Мы применяли модифицированный метод Speirs [15]. Гомогенат (6 г) с добавленным внутренним стандартом переносили в герметически закрытый 10-миллилит-ровый сосудик с силиконово-тефлоновой пробкой. Мы использовали два внутренних стандарта для всего спектра анализируемых летучих соединений: 2-октанон для С6-С10 соединений и анетол для С11—С15 летучих соединений, фенолов, метил-салицилата и эугенола. Для твердофазной ми
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.