научная статья по теме ВЛИЯНИЕ ПОЛИКАТИОННЫХ ПЕПТИДОВ РАЗЛИЧНОЙ ПРИРОДЫ НА ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ РЕГУЛИРУЕМОЙ СЕРОТОНИНОМ АДЕНИЛАТЦИКЛАЗНОЙ СИГНАЛЬНОЙ СИСТЕМЫ В МОЗГЕ КРЫС Медицина и здравоохранение

Текст научной статьи на тему «ВЛИЯНИЕ ПОЛИКАТИОННЫХ ПЕПТИДОВ РАЗЛИЧНОЙ ПРИРОДЫ НА ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ РЕГУЛИРУЕМОЙ СЕРОТОНИНОМ АДЕНИЛАТЦИКЛАЗНОЙ СИГНАЛЬНОЙ СИСТЕМЫ В МОЗГЕ КРЫС»

НЕЙРОХИМИЯ, 2009, том 26, № 4, с. 302-311

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ

УДК 572.788:577.151.6

ВЛИЯНИЕ ПОЛИКАТИОННЫХ ПЕПТИДОВ РАЗЛИЧНОЙ ПРИРОДЫ

НА ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ РЕГУЛИРУЕМОЙ СЕРОТОНИНОМ АДЕНИЛАТЦИКЛАЗНОЙ СИГНАЛЬНОЙ СИСТЕМЫ

В МОЗГЕ КРЫС

© 2009 г. А. О. Шпаков1' *, И. А. Гурьянов2, И. И. Тарасенко2, Г. П. Власов2

1Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, лаборатория молекулярной эндокринологии 2Институт высокомолекулярных соединений РАН, лаборатория биологически активных полимеров,

Санкт-Петербург

Поликатионные пептиды являются одними из важнейших регуляторов функциональной активности гормональных сигнальных систем, в том числе аденилатциклазной сигнальной системы (АЦ-системы), у животных различного филогенетического уровня. Нами проведено сравнительное изучение влияния трех синтетических поликатионных пептидов [C-eAhx-YKAKKKKKKKWK (I), CK(C10)-eAhx-YKAKKKKKKKWK (II), №2)64(^32(^6(^(^)4(^)2:^ (Ш)], а также пептидного токсина мастопарана, не имеющих гомологии с сигнальными белками, и синтетических поликатионных пептидов ARERKATKTL255-264K (IV) и HSRKALKASL306-315K (V), производных С-концевых участков третьей цито-плазматической петли серотониновых рецепторов (СР) 1В-подтипа и 6-го типа, на функциональное состояние АЦ системы в тканях мозга крыс. Пептиды I, II и III стимулировали гетеротримерные О-белки как стимулирующего (О8), так и ингибирующего (О^ типа, пептид IV и мастопаран действовали преимущественно на Огбелки, пептид V в большей степени активировал Отбелки. Пептиды II и V стимулировали базальную активность аденилатциклазы (АЦ), в то время как мастопаран и пептиды III и IV ингибировали активность фермента, стимулированного форсколином. Стимуляция АЦ серотонином в наибольшей степени снижалась в присутствии пептида V, производного СР 6-го типа, сопряженного с О8-белками (порядок эффективности ингибирующего действия пептидов: V > II > III > IV = мастопаран = I), в то время как инги-бирующий АЦ-эффект серотонина - в присутствии пептида IV, производного СР 1В-подтипа, сопряженного с Огбелками (порядок эффективности: IV > III = мастопаран > II > I > V). Ингибирующий АЦ-эффект Б2-агониста бромкриптина в наибольшей степени снижался в присутствии мастопарана и пептида III, а пептид IV в этом случае был менее активным (мастопаран > III > IV > II > I = V). Среди изученных поликатионных пептидов пептиды IV и V, производные СР, наиболее эффективно ингибировали стимуляцию связывания ОТР серотонином и специфическое связывание гормона с мембранами, причем их действие выявлялось в концентрации 10-6 М. Таким образом, в отличие от поликатионных пептидов, не имеющих гомологии с сигнальными белками, поликатионные пептиды, производные СР, с высокой селективностью и эффективностью влияют на функциональное состояние регулируемой серотонином АЦ-системы в мозге крыс и на передачу через нее гормонального сигнала.

Ключевые слова: аденилатциклаза, аденилатциклазная сигнальная система, О-белок, мастопаран, мозг, поликатионный пептид, серотонин, серотониновый рецептор, цитоплазматическая петля.

ВВЕДЕНИЕ

Исследования последних лет свидетельствуют о том, что различные по структурной организации и происхождению поликатионные пептиды входят в число важнейших регуляторов гормональных сигнальных систем у животных различного филогенетического уровня - от одноклеточных организмов до высших позвоночных [1]. Несмотря на то, что поликатионные пептиды способны взаимодействовать с различными компонентами этих систем, основными их мишенями являются гетеротримерные вТР-свя-зывающие белки (в-белки), которые осуществляют

* Адресат для корреспонденции: 194223, Санкт-Петербург, пр. Тореза 44, тел.: (812) 552-31-17, е-шаЛ: alex_shpakov@ list.ru

сопряжение между рецептором серпантинного типа и ферментами - генераторами вторичных посредников, такими как аденилатциклаза (АЦ) или фосфо-липаза С. В основе этого лежит имитация поликати-онными пептидами участков рецептора, которые ответственны за взаимодействие с а-субъединицей в-белка. Эти участки локализованы в цитоплазмати-ческих петлях рецептора и, как правило, обогащены положительно заряженными аминокислотными остатками (АКО), в то время как взаимодействующие с ними С-концевые участки а-субъединиц, напротив, заряжены отрицательно. Вследствие этого в основе образования функционально активного комплекса между активированным рецептором и а-субъединицей в-белка лежат электростатические

взаимодействия, интенсивность которых в значительной степени зависит от окружения боковых заряженных групп АКО и их доступности для контактов с другими заряженными группами. Наиболее оптимальной для взаимодействия с G-белком является а-спиральная конформация поликатионных участков цитоплазматических петель рецепторов, что обеспечивается локализованными в этих участках спиралеобразующими мотивами BBXXB-типа, где B - положительно заряженный АКО (обычно аргинин или лизин) [2-7]. Такие мотивы обнаружены в большинстве рецепторов, сопряженных с G-белками, в том числе и в серотониновых рецепторах (СР) [8].

В настоящее время выявлено несколько классов поликатионных пептидов, различающихся по структурно-функциональной организации и происхождению, которые способны эффективно и, в ряде случаев, селективно взаимодействовать с G-белками. Среди них пептидные токсины из яда насекомых мастопаран [9] и мелиттин [10], пептидные гормоны позвоночных животных (ангиотензин II, динорфин, брадикинин, субстанция P) [11], регуляторный фактор аденорегулин [12], а также пептидные аутоин-дукторы бактерий (лантибиотики А-типа, CSP-пеп-тиды, энтероцины) [13]. Эффективными регуляторами сопряженных с G-белками сигнальных систем являются синтетические поликатионные пептиды, которые соответствуют по аминокислотной последовательности участкам рецепторов, функционально важным для взаимодействия с G-белками [14, 15]. Активаторами G-белков являются и синтетические поликатионные пептиды, не имеющие гомологии с этими участками, но сходные с ними по пространственной организации. Среди них линейные пептиды с регулярной структурой [16], линейные пептиды, модифицированные гидрофобными радикалами [16, 17], а также звездообразные пептиды, сконструированные на основе последовательности 48-60 TAT-белка вируса иммунного дефицита человека [18, 19]. К отдельному классу поликатионных пептидов, активаторов G-белков, можно отнести пептиды, сконструированные на основе лизина и его олигомеров, которые имеют как разветвленную [20-22], так и дендримерную сферическую структуру [23].

Целью работы было сравнительное изучение молекулярных механизмов действия различных по структуре, функциям и происхождению поликатионных пептидов на функциональную активность регулируемой серотонином АЦ-системы в мозге крыс и, в частности, исследование их взаимодействия с гете-ротримерными G-белками стимулирующего и ингибирующего типа, выполняющими функцию сопрягающего компонента в АЦ-системе позвоночных животных. Для исследования были взяты впервые синтезированные нами пептиды, производные С-концевых участков третьей цитоплазматической петли (С-ЦП-3) СР Ш-подтипа и 6-го типа, а также три синтетических поликатионных пептида и мастопаран, пептидный токсин из яда насекомых, не имеющие гомологии с сигнальными белками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В опытах использовали самцов крыс линии Wistar возраста 1SG-21G дней. Фракцию плазматических мембран из стриатума и коры головного мозга выделяли по методу Hajos [24] с нашими модификациями [19], для получения каждой фракции брали по б—S крыс. Полученные фракции использовали для исследования активности AЦ и связывания GTP, а также для изучения параметров связывания серото-нина с рецепторами.

Для проведения экспериментов использовали следующие реактивы: серотонин, бромкриптин, ма-стопаран из Polistes jadwagae, креатинфосфат, кре-атинфосфокиназу из мышц кролика (НФ 2.7.3.2), имидазол, ATP, cAMP, GTP, ß,y-имидогyaнозин-5'-трифосфат (Gpp[NH]p), HEPES-Na, Tris-OH, Lu-brol-PX, ЭЩА., ДТТ, БCA (все реактивы фирмы Sigma, CШA). ^лоночную хроматографию проводили на нейтральной окиси алюминия (Reanal, Венгрия), для определения связывания серотони-на с рецепторами применяли фильтры GF/C (Sigma, CMA), для определения связывания GTP - нит-роцеллюлозные фильтры тип HA, G.45 мкм (Milli-pore, C^MA). Для изучения связывания серотонина с рецепторами использовали 5-[1,2-3Й(^]-гид-рокситриптамин ([3щ-серотонин) (27 kh^m) (NEN, CШA), для определения активности AЦ -[a-32P]ATP (4 ^/мМ) (Изотоп, Россия), для определения GTP-связывания - ß,y-имидо[S-3H]-гyaнозин-5'-трифосфата аммонийную соль ([8-3H]GppNHp) (5 ^MM) (Amersham, Arnera).

Поликатионные пептиды C-eAhx-

YKAKKKKKKKWK (I) и CK(C1G)-eAhx-YKAKKKKKKKWK (II), где eAhx - остаток e-амино-гексановой кислоты, C1G - остаток каприновой кислоты, а также полилизиновый гомодендример пятой генерации (N^K^^aK^K^K^KA (III) были получены, как описано ранее [17, 19, 23]. Пептиды RMHLRQYELL и KNNLKDCGLF, которые соответствуют C-концевым участкам 3S5-394 as- и 34б-355 а^-субъединиц G-белков млекопитающих, были синтезированы, как описано ранее [25, 2б].

Cинтетические пептиды ARERKATKTL255-264K (IV) и HSRKALKASL3G6-315K (V), производные C-ЦП-3 CP 1B-подтипa и б-го типа крысы, модифицированные с C-конца остатками лизина, были получены в соответствии со стандартным твердофазным методом синтеза пептидов с использованием трет-бути-локсикарбонильной, бензильной, мезитиленсульфо-нильной, 2-хлорбензилоксикарбонильной групп для защиты функциональных групп аминокислот. В качестве полимерного носителя использовали napa-ме-тилбензгидриламинную смолу со средней емкостью G.55 ммоль/г (G.25 ммоль). ^тез проводили с помощью полуавтоматического синтезатора NPS-4GGG (Neosystem Laboratoires, Франция). Присоединение AKO осуществляли карбодиимидным методом с помощью диизопропилкарбодиимида в присутствии 1-гидроксибензотриазола в течение 1-2 ч. Полное

деблокирование и удаление пептидов с полимера осуществляли с помощью трифторметансульфокис-лоты (1 мл) в трифторуксусной кислоте (10 мл) в присутствии 1 мл тиоанизола и 0.5 мл этандитиола

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком