КОЛЛОИДНЫЙ ЖУРНАЛ, 2014, том 76, № 4, с. 500-505
УДК 544.723.2.023.2
ВЛИЯНИЕ ПОЛИСТИРОЛСУЛЬФОНАТА НАТРИЯ НА ДИНАМИЧЕСКИЕ ПОВЕРХНОСТНЫЕ СВОЙСТВА РАСТВОРОВ БЫЧЬЕГО СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА © 2014 г. О. Ю. Миляева*, Shi-Yow Lin**, Б. А. Носков*
*Санкт-Петербургский государственный университет 198504 Санкт-Петербург, Университетский проспект, 26 **National Taiwan University of Science and Technology 43 Keelung Road, Section 4, Taipei, 106 Taiwan e-mail: borisanno@mail.ru Поступила в редакцию 13.12.2013 г.
Динамическая поверхностная упругость растворов комплексов бычьего сывороточного альбумина (БСА) с полистиролсульфонатом натрия (ПСС) измерялась методом осциллирующего кольца в зависимости от возраста поверхности, концентрации полиэлектролита и рН раствора. При значениях pH ниже изоэлектрической точки БСА наблюдается увеличение скорости изменения поверхностных свойств, что связано с уменьшением электрического адсорбционного барьера в результате уменьшения общего заряда комплекса белок/полиэлектролит. При этом на кинетических зависимостях поверхностной упругости возникает локальный максимум, указывающий на начало разрушения третичной структуры белка в поверхностном слое. В области pH, соответствующей одноименному заряду белка и полиэлектролита, наблюдается уменьшение скорости изменения поверхностных свойств. В этом случае также образуется комплекс БСА/ПСС за счет взаимодействия ПСС с отдельными участками поверхности глобулы, имеющими заряд, противоположный суммарному заряду молекулы белка. Увеличение отрицательного заряда комплекса по сравнению с глобулами белка приводит к увеличению адсорбционного электрического барьера и уменьшению скорости изменения поверхностных свойств. При этом зависимости поверхностной упругости от поверхностного давления совпадают с зависимостями для раствора белка. Это означает, что взаимодействие полиэлектролита с белком влияет только на кинетику адсорбции, а поверхностные свойства вблизи равновесия определяются адсорбированными глобулами белка.
Б01: 10.7868/80023291214040107
ВВЕДЕНИЕ
Белки и полиэлектролиты интенсивно взаимодействуют в водном растворе с образованием растворимых комплексов, способных к дальнейшей агрегации при более высоких концентрациях компонентов и образованию коацерватов. Комплексы белок/полиэлектролит находят применение в различных отраслях промышленности в качестве биокатализаторов [1], биосенсоров [2, 3], используются при разделении и очистке белков [4, 5], а также при направленной доставке лекарственных препаратов [6].
Водные растворы смесей бычьего сывороточного альбумина и полистиролсульфоната натрия (БСА/ПСС) изучались с помощью малоуглового рассеяния нейтронов [7], динамического и статического рассеяния света [8, 9], определения элек-трофоретической подвижности частиц [8], измерения мутности [7—9]. На взаимодействие между макромолекулами влияют такие факторы как рН
и ионная сила раствора, соотношение концентраций компонентов, плотность заряда вдоль цепи полиэлектролита и на поверхности глобулы белка.
Интерес к растворам комплексов БСА/ПСС во многом обусловлен возможностью широко варьировать параметры данной системы и, тем самым, выделить основные факторы, определяющие механизм взаимодействия компонентов. Кроме того, различные уровни структуры БСА хорошо изучены, что позволяет использовать его в качестве модели при изучении физико-химических свойств растворов белков. Глобула БСА состоит из трех слабо связанных между собой доменов и имеет сердцевидную форму вблизи изо-электрической точки (рН ~ 5) [10]. С изменением рН изменяется не только заряд белка [11], но и его третичная структура [12], что, в свою очередь, влияет как на объемные и поверхностные свойства растворов самого БСА, так и на свойства комплексов БСА/полиэлектролит.
В работе [7] с помощью измерения мутности и малоуглового рассеяния нейтронов было обнаружено, что при изменении рН раствора с 7 до 3 свойства растворов БСА/ПСС значительно изменяются. При рН от 6 до 7 раствор остается полностью прозрачным, что указывает на высокую растворимость первичных комплексов, возникающих в этой области значений рН [9]. При этом общий заряд глобулы БСА остается отрицательным и при значении рН, соответствующем началу образования комплексов, равен —12 [8, 9]. При дальнейшем уменьшении рН начинается постепенный рост мутности с максимумом при рН 4, соответствующем образованию коацерватов. По мере удаления от изоэлектрической точки уменьшается компактность комплекса. Характеристический размер растворимого комплекса по данным электрофоретического рассеяния света составляет от 46 до 63 нм в зависимости от рН. Из данных по рассеянию нейтронов в [7] был сделан вывод о фрактальной структуре комплексов и применимости к ним модели ожерелья, в которой белок случайным образом распределен вдоль цепи полиэлектролита. При изменении соотношения компонентов различия в зависимостях интенсивности рассеяния от модуля вектора рассеяния оказались незначительными. Это позволило предположить, что структура комплексов не зависит от соотношения компонентов и при любой концентрации часть молекул полиэлектролита полностью насыщена белком, а другая часть находится в свободной форме.
Важно отметить, что взаимодействие между БСА и ПСС наблюдается даже в условиях, когда молекулы несут одинаковый заряд [8, 9]. Вероятно, это связано с тем, что достаточно гибкая молекула ПСС может взаимодействовать с отдельными участками глобулы БСА, заряд которых отличается от общего заряда белка [9]. Это предположение также подтверждается данными по электрофоре-тической подвижности комплексов, которая становится отрицательной при взаимодействии между макромолекулами. Для преодоления электростатического отталкивания и образования комплекса отрицательно заряженной глобулы белка с полианионом поверхность глобулы должна иметь участки с преобладанием положительного заряда.
Несмотря на то, что растворы смесей белок/полиэлектролит часто используются в виде дисперсий или тонких пленок, информация о поверхностных свойствах этих систем крайне ограничена [13, 14]. Недавно было показано, что процессы разрушения глобул белка в адсорбционной пленке и образования дальней области поверхностного слоя (области петель и хвостов) могут быть исследованы с помощью дилатационной поверхностной реологии [15—17]. В данной работе этот метод применен к растворам комплексов БСА/ПСС с целью оценки влияния взаимодей-
ствия с полиэлектролитом на состояние белковой глобулы на границе водного раствора с воздухом.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Динамическую поверхностную упругость измеряли методом осциллирующего кольца, подробно описанным ранее [18—20]. Стеклянное кольцо, внутренняя поверхность которого была отшлифована для улучшения смачивания, и с осью, перпендикулярной исследуемой поверхности жидкости, частично погружали в эту жидкость. Колебания кольца вдоль его оси приводили к колебаниям площади поверхности жидкости в результате периодических изменений формы мениска у внутренней поверхности кольца. Частота и амплитуда колебаний площади поверхности составляли 0.1 Гц и 3.7%, соответственно. Возникающие колебания поверхностного натяжения внутри кольца измеряли методом пластинки Вильгельми. Поверхностное натяжение у и площадь поверхности А оказывались синусоидальными функциями возраста поверхности ? и, следовательно, могли быть представлены в комплексной форме. Тогда комплексную динамическую поверхностную упругость е при заданной угловой частоте ю можно определить следующим соотношением:
б(ю) = бге + /б;т = 5у/5 1пЛ.
Использование стеклянного кольца для создания колебаний площади поверхности жидкости позволяло добиться однородного растяжения/сжатия поверхности и, следовательно, минимизировать вклад сдвиговых деформаций в измеряемую поверхностную упругость. Для исследуемых систем мнимая часть динамической поверхностной упругости была близка к нулю, и модуль динамической поверхностной упругости в пределах погрешности совпадал с ее действительной частью.
БСА с молекулярной массой 64000 (81§ша-Л1-ёйсИ, Германия) использовали без дальнейшей очистки. Растворы БСА готовили разбавлением исходного раствора с концентрацией С = 0.25 г/л, который хранили при температуре ниже 10°С не более одной недели.
ПСС с молекулярной массой ~70000 (81§ша-ЛЫйсИ, Германия) также использовали без дальнейшей очистки. Растворы ПСС готовили разбавлением исходных растворов с концентрацией С = 2 и 0.02 г/л.
Растворы с рН = 7 готовились в фосфатном буфере путем добавления небольшого избыточного количества одного из компонентов буферной смеси — №2НР04 или №Н2Р04 (81§ша-ЛЫйсИ, Германия). Растворы с рН, отличным от нейтрального, готовили с помощью добавления НС1 и №ОН к раствору хлорида натрия (Вектон, Санкт-Петербург). Хлорид натрия предваритель-
502
МИЛЯЕВА и др.
—си-сн.
2
803 _
Рис. 1. Структура молекулы ПСС.
Модуль поверхностной упругости, мН/м 80
70 ^ 1
60 50 40 30 20 10
0_
0 50 100 150 200 250 300 350
Время, мин
Рис. 2. Кинетические зависимости модуля динамической поверхностной упругости растворов смеси БСА/ПСС при рН 7, концентрации белка 5 х 10-2 мг/мл и концентрации ПСС 0 (1), 2 х 10-5 (2), 2 х 10-4 (3), 2 х 10-3 (4), 2 х 10-2 (5) и 2 х 10-1 мг/мл (б).
Поверхностное натяжение, мН/м 74
72 70 68 66 64 62
60
1
0 50 100 150 200 250 300
Время, мин
Рис. 3. Кинетические зависимости поверхностного натяжения растворов смеси БСА/ПСС при рН 7, концентрации белка 5 х 10-2 мг/мл и концентрации ПСС 0 (1), 2 х 10-5 (2), 2 х 10-4 (3), 2 х 10-3 (4), 2 х 10-2 (5) и 2 х 10-1 мг/мл (б).
но прокаливали в муфельной печи при температуре ~800°С. Для всех растворов ионная сила составляла 0.02 М.
При приготовлении растворов использовалась трижды перегнанная вода. Две последние перегонки осуществляли на установке, целиком сделанной из стекла. Поверхностное натяжение буферного раствора без белка составляло 72.8 мН/м.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Для исследования смешанных адсорбционных пленок БСА и ПСС (рис. 1) были измерены поверхностное натяжение и поверхностная упругость растворов смеси как функции времени и концент
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.