БИОХИМИЯ, 2014, том 79, вып. 1, с. 57 - 67
УДК 577.23
ВЛИЯНИЕ ПОТЕНЦИАЛЗАВИСИМОГО ВХОДА КАЛИЯ НА ОБРАЗОВАНИЕ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА В МИТОХОНДРИЯХ МОЗГА КРЫС
© 2014 г. О.В. Акопова*, Л.И. Колчинская, В.И. Носарь, В.А. Бурый, И.Н. Маньковская, В.Ф. Сагач
Институт физиологии им. А.А. Богомольца НАН Украины, 01601 Киев-24, ул. Богомольца, 4; электронная почта: a-dubensky@mail.ru
Поступила в редакцию 09.07.13 После доработки 16.09.13
Изучено влияние потенциалзависимого входа K+ на образование активных форм кислорода (АФК) в митохондриях мозга крыс. Показано, что влияние входа K+ на продукцию АФК в стационарном состоянии 4 обусловлено изменениями мембранного потенциала митохондрий (А^). В области концентраций K+ 0—120 мМ повышение начальной скорости входа K+ в матрикс приводит к снижению и стационарной скорости образования АФК вследствие ^-индуцированной митохондриальной деполяризации. Селективное блокирование АТР-зависимого ^-канала (K+д-р-канала) глибенкламидом и 5-гидроксидеканоатом приводит к повышению продукции АФК вследствие реполяризации мембраны, обусловленной частичным блокированием потенциалзависимого входа K+. Установлено, что АТР-зависимый транспорт K+ составляет ~40% потенциалзависимого входа K+ в митохондриях мозга. Результаты экспериментов свидетельствуют, что потенциалзависимый транспорт K+ является физиологически важным регулятором образования АФК в митохондриях мозга, и позволяют сделать вывод, что функциональная активность нативного KAxp-канала этих органелл в физиологических условиях может служить эффективным инструментом предупреждения гиперпродукции АФК в нейронах мозга.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: калий, митохондрии мозга, активные формы кислорода, K+да-канал.
Митохондрии являются основными потребителями клеточного кислорода и основными производителями активных форм кислорода (АФК) [1—3]. В процессе аэробного метаболизма дыхательная цепь митохондрий потребляет более 90% кислорода клетки; около 2% потребляемого кислорода может в определенных условиях превращаться в АФК, продукты его неполного восстановления [1, 2]. Митохондриальная дисфункция, связанная с нарушениями энергетического метаболизма митохондрий вследствие блокирования транспорта электронов либо разобщения дыхательной цепи, может приводить как к гиперпродукции АФК, так и к подавлению их образования в физиологически необходимых количествах. Хорошо известно также, что АФК являются индукторами открывания циклоспорин-чувствительной поры [4] и клеточного апоптоза [5, 6]. Это объясняет повышенное внимание исследователей к изучению механизмов генерации АФК дыхательной цепью митохондрий. К настоящему времени выявлены основные сайты и ряд основных регуляторных
* Адресат для корреспонденции.
механизмов образования АФК в митохондриях [1-3, 7].
Известно, что наибольшее количество АФК первоначально образуется в виде супероксида (О"2) в комплексах I и III дыхательной цепи [1-3]. Более точная локализация сайтов образования АФК дискутируется в литературе. Наиболее вероятные центры образования АФК в комплексе I по данным разных авторов — FMN-связывающий сайт [7], FeS-кластеры, N 1а [8] либо N 2 [9] и, возможно, убихинон-связываю-щий сайт [10]. В комплексе III супероксид образуется вследствие автоокисления убисемихино-на, CoQ", гипотетического свободнорадикаль-ного интермедиата Q-цикла [2, 3]. Основными предпосылками генерации АФК являются высокий мембранный потенциал (А¥т) и восстановленное состояние пулов пиридиновых нук-леотидов (NADH/NAD+) и убихинона (CoQH2/ /CoQ) [1, 3, 11].
Гиперполяризация митохондрий в состоянии 4 соответствует максимальному восстановлению редокс-активных сайтов дыхательной цепи [1, 3]. Перенос электрона на кислород с образованием О^ становится термодинамически бо-
лее выгодным, чем транспорт электронов по градиенту редокс-потенциала, что ведет к «утечке электронов» на кислород с образованием супероксида [1, 11, 12].
Образованию АФК в комплексе I способствуют высокий мембранный потенциал и восстановленное состояние пиридиновых нуклео-тидов и убихинона, в особенности в условиях обратного транспорта электронов [1, 3, 7]. В комплексе III образование АФК зависит от ре-докс-потенциала гемов цитохрома Ь и стационарной концентрации убисемихинона, СоР" [1, 2, 12]. Ее повышение вследствие гиперполяризации мембраны и восстановления цитохрома Ь [12] либо блокирования транспорта электронов антимицином А ведет к автоокислению СоР" [2] и высокому выходу АФК [13, 14].
Важным физиологическим модулятором образования АФК в митохондриях является потен-циалзависимый вход К+ [15]. Интерес к нему заметно возрос в связи с выявлением цитопротек-торных эффектов фармакологических активаторов АТР-зависимого К+-канала, КдХР-канала [16—18]. Известно, что во внутренней мембране митохондрий присутствует множество типов К+-каналов, обеспечивающих потенциалзави-симый вход К+ [18, 19]. АТР-зависимый вход К+ преобладает над другими типами К+-проводи-мости, и его биоэнергетические эффекты наиболее исследованы.
Полагают, что в основе цитопротекторного действия активаторов К+ХР-канала (как и транспорта К+ в целом) лежит феномен «мягкого разобщения» дыхательной цепи [20], одним из основных последствий которого является предотвращение гиперпродукции АФК [11, 16, 21]. Однако в литературе получены неоднозначные данные о влиянии активаторов К+ХР-канала на образование АФК в митохондриях. Так, в ряде работ было показано снижение продукции АФК при активации К+ХР-канала митохондрий сердца и печени [22, 23]. В то же время, в работах группы Гарлида установлено, что активация К+ХР-канала митохондрий сердца повышает образование АФК вследствие защелачивания мат-рикса митохондрий [24]. Как понижение, так и повышение продукции АФК в митохондриях, по данным литературы, может приводить к ци-топротекторным эффектам. В первом случае механизм клеточной защиты обусловлен подавлением открывания митохондриальной поры, индуктора апоптоза [22], поскольку АФК являются ее индукторами [4—6]. Во втором случае протекторный эффект обусловлен активацией митохонд-риальной изоформы протеинкиназы С перекисью водорода в матриксе, что, в итоге, также ведет к блокированию митохондриальной поры
[25]. Однако, несмотря на удовлетворительное объяснение механизмов протекторного действия активаторов митохондриального К+ХР-канала, все же очевидно, что вопрос о роли АТР-зависи-мого входа К+ в регуляции образования АФК еще не решен.
Следует отметить, что в большинстве работ для изучения биоэнергетических эффектов АТР-зависимого входа К+ использовались фармакологические активаторы К+ХР-канала [22—25]. В то же время, для более адекватного понимания физиологических функций КдХР-канала, как и других митохондриальных К+-каналов, представляет интерес оценка вклада разных типов эндогенной К+-проводимости в биоэнергетические эффекты потенциалзависимого входа К+ в нативных изолированных митохондриях в отсутствие фармакологических активаторов. Целью настоящей работы было изучение влияния потенциалзависимого входа К+ на образование АФК в митохондриях мозга крыс и выявление вклада К+ХР-канала в регуляцию продукции АФК в этих органеллах.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В опытах использовали белых крыс линии Вистар с массой тела 200—250 г. Мозг промывали охлажденным 0,9%-ным раствором KCl (4°), измельчали и гомогенизировали в 5х объеме среды (250 мМ сахароза, 20 мМ Tris-HCl-буфер, 1 мМ ЭДТА, 1 мг/мл БСА, рН 7,4). Для выделения митохондрий гомогенат центрифугировали 7 мин при 1000 g (4°). Затем супернатант центрифугировали 15 мин при 12 000 g (4°). Осадок суспендировали в небольшом объеме среды без добавления ЭДТА и БСА и хранили во льду при 4°. Содержание белка определяли методом Лоури.
Образование АФК изучали по изменению флуоресценции дихлорофлуоресцеина [24]. Для этого митохондрии нагружали нефлуоресциру-ющим проникающим зондом, 2',7'-дигидроди-хлорофлуоресцеин диацетатом (DCFH-DA), который гидролизуется в матриксе до непроникающего производного (дигидрофлуоресцеина) и, после окисления митохондриальными АФК, образует дихлорофлуоресцеин (DCF). Суспензию митохондрий нагружали DCFH-DA (конечная концентрация 200 мкМ) в течение 20 мин при 37°; после загрузки пробы и отмывки внешнего зонда путем переосаждения митохондрий суспензию хранили во льду. Аликвоты суспензии (количество белка — 1 мг/мл) вносили в среду инкубации, регистрировали флуоресценцию DCF при длинах волн возбуждения и эмиссии 504 и 525 нм. Из величины флуоресцентного
сигнала (F) вычитали базальную флуоресценцию (F0), обусловленную внесением митохондрий в среду инкубации, которую находили путем экстраполяции кинетических кривых к нулевому моменту времени.
Транспорт ионов Н+ изучали по изменению флуоресценции рН-чувствительного зонда 2',7'-бис-(2-карбоксиэтил)-5(6)-карбоксифлуорес-цеина (BCECF) вследствие изменения рН мат-рикса (pHj) предварительно нагруженных митохондрий при длинах волн возбуждения и эмиссии 509 и 535 нм. Митохондрии предварительно нагружали BCECF-АМ (конечная концентрация 10 мкМ [26]) в течение 10 мин при 37° с последующим переосаждением митохондрий для отмывки от избыточного количества зонда. Для оценки скорости транспорта протонов аликво-ты суспензии (0,5 мг/мл) титровали раствором HCl в среде инкубации без добавления сукцината в присутствии 5 • 10—6 М ротенона и 1 мкМ кар-бонилцианид-т-хлорфенилгидразона (СССР), параллельно регистрируя изменение флуоресценции BCECF; в тех же условиях определяли изменение рН с помощью стеклянного микроэлектрода, объем среды составлял 1 мл. По калибровочным кривым находили амплитуду изменения рН1 и начальную скорость транспорта протонов (нмоль ионов Н+ • мин-1 • мг-1). Из величины флуоресцентного сигнала, как и в случае DCF, вычитали базальную флуоресценцию митохондрий (F0) в нулевой момент времени.
Мембранный потенциал митохондрий (количество белка - 1 мг/мл) регистрировали в среде инкубации в присутствии 10 мкМ сафранина при длинах волн возбуждения и эмиссии 495 и 586 нм [22]. Находили разность между флуоресценцией деполяризованных и энергизованных митохондрий, для деполяризации вносили 10-6 М СССР.
Потр
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.