ш
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2015, том 41, № 3, с. 292-298
УДК 577.151.042
ВЛИЯНИЕ ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ РАЗЛИЧНОЙ ПРИРОДЫ НА БАКТЕРИОЛИТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ЛИЗОЦИМА
© 2015 г. Р. А. Иванов#, О. А. Соболева, С. А. Смирнов, П. А. Левашов
Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, химический факультет, 119991, Москва, Воробьевы горы, д. 1, стр. 3 Поступила в редакцию 09.09.2014 г. Принята к печати 15.10.2014 г.
Изучено влияние поверхностно-активных веществ (ПАВ) различной природы: анионного (доде-цилсульфат натрия, SDS), катионного (бромид додецилтриметиламмония, DTAB) и цвиттер-ион-ного (кокоамидопропил бетаин, CAPB) — на лизис грамположительных бактерий Micrococcus luteus под действием яичного лизоцима при рН 7.2 и ионной силе раствора 0.15 М. Установлено, что при малых концентрациях SDS и DTAB (менее 10-5 М) происходит рост бактериолитической активности лизоцима на 30—140%. При более высоких концентрациях (10-5—10-4 М) активность снижается до значений, полученных в отсутствие ПАВ. Рост активности соотнесен с формированием гидрофобных комплексов лизоцим—ПАВ. При добавлении САРВ в концентрации свыше 10-5 М лизис M. luteus существенно замедляется, что связано с агрегированием лизоцима под действием САРВ.
Ключевые слова: лизоцим, поверхностно-активные вещества, лизис, Micrococcus luteus.
DOI: 10.7868/S0132342315020050
ВВЕДЕНИЕ
Водные растворы смесей ферментов и поверхностно-активных веществ (ПАВ) представляют интерес вследствие их широкого использования в биотехнологии, медицине, косметической и пищевой промышленности, при создании моющих средств и в других областях [1, 2]. В водных растворах между белками и ПАВ осуществляются нековал ентные взаимодействия различной природы: электростатические, гидрофобные, ион-ди-польные и др. Как правило, вначале происходит специфическое связывание полярных групп ПАВ с адсорбционными центрами на поверхности макромолекулы белка. В результате формируются комплексы, более гидрофобные, чем нативный белок. С ростом концентрации ПАВ взаимодействие осуществляется по механизму гидрофобного связывания с образованием гидрофильных комплексов [3—7]. Связывание ферментов с ПАВ может приводить к нарушению третичной и даже вторичной структуры молекул белка, и, соответственно, к потере каталитической активности. Денатурация белка обычно наблюдается при таких концентрациях ПАВ, когда происходит уси-
Сокращения: САРВ — кокоамидопропилбетаин; ОТАВ — бромид додецилтриметиламмония; 8В8 — додецилсульфат натрия.
# Автор для связи (тел.: +7 (925) 056-57-49; факс: +7 (495) 932-88-46; эл. почта: ivanov_r_a@mail.ru).
ление неспецифических кооперативных взаимодействий.
Ранее было показано, что добавки анионных ПАВ, таких как алкилсульфаты, алкилсульфона-ты, абкилбензолсульфонаты натрия, приводят к снижению бактериолитической активности лизоцима по отношению к грамположительным бактериям Micrococcus lysodeikticus [8, 9]. Введение в систему реагентов, специфически связывающих анионные ПАВ (катионных ПАВ [8] или гидрок-сипропил-Р-циклодекстрина [9]), приводит к полному восстановлению структуры лизоцима и его активности. Денатурирующее действие доде-цилсульфата натрия на лизоцим также снижается в присутствии неионогенных или цвиттер-ион-ных ПАВ [1]. Анионные ПАВ не всегда вызывают денатурацию лизоцима: так, например, ферментативная активность лизоцима сохраняется после его экстракции из растворов обратных мицелл бис(2-этилгексил)сульфосукцината натрия (АОТ) [10—12]. Додецилсульфат натрия оказывает инак-тивирующее действие на каталазу из печени быка, однако не влияет на активность бактериальной каталазы [13]. Добавки анионных ПАВ с короткой (C6—C8) углеводородной цепью не влияют на активность алкогольдегидрогеназы, а ПАВ с более длинной (C10—C12) или разветвленной алкильной цепью, а также катионный цетилтриметиламмо-ний бромид уменьшают активность энзима [14].
При исследовании влияния ПАВ различной природы на активность липазы Thermomyces lanuginosus было установлено, что малые добавки ПАВ увеличивают активность фермента, однако при высоких концентрациях происходит снижение активности до значений, полученных в отсутствие ПАВ [15]. Аналогичным образом ионогенные ПАВ действуют на активность фосфолипазы C, в то время как неионогенные и цвиттерионные ПАВ не влияют на активность этого фермента [16]. Повышение активности эндолизина бактериофага в лизисе клеток Salmonella enteritidis и Escherichia coli наблюдалось в присутствии высокомолекулярных ПАВ и плюроников с крупным гидрофобным блоком [17]. Некоторые ПАВ оказывают на белки стабилизирующее действие, повышая их устойчивость к тепловой денатурации [1, 18].
Целью настоящей работы стало изучение влияние добавок ПАВ различной природы в широкой области концентраций на лизис лизоцимом клеток Micrococcus luteus в водных растворах при рН 7.2 и концентрации NaCl, близкой к концентрации физиологического раствора.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
При исследовании влияния ПАВ на лизис M. luteus под действием лизоцима на первом этапе было определено, как влияют ПАВ и лизоцим по отдельности на изменение поглощения суспензии клеток во времени А = —dOD/dt [19—21]. Установлено, что SDS и DTAB при концентрации менее 10-4 М не влияют на величину А. При более высоких концентрациях ПАВ происходило заметное изменение поглощения во времени, поэтому в дальнейшем исследования проводились в области концентраций этих ПАВ от 10-7 до 10-4 М. Отметим, что этот диапазон концентраций существенно меньше критических концентраций ми-целлообразования (ККМ) SDS и DTAB, составляющих 8 х 10-3 и 1 х 10-2 М соответственно. Таким образом, указанные ПАВ в изученных растворах присутствуют в молекулярной форме. Добавки САРВ вплоть до концентрации 10-3 М (эта концентрация близка к ККМ САРВ) практически не влияют на изменение поглощения суспензии M. luteus во времени.
Скорость лизиса увеличивается с ростом концентрации лизоцима (рис. 1). Зависимость не является линейной, что указывает на сложный механизм изучаемого процесса. Поэтому сопоставление активностей в присутствии и в отсутствие ПАВ позволяет сделать в основном качественные выводы о влиянии ПАВ на бактериолитическую активность лизоцима.
На рис. 2 и 3 представлены зависимости скорости бактериального лизиса от концентрации SDS и DTAB соответственно. Величины активности
0.2 0.3 [Лизоцим], г/л
Рис. 1. Зависимость активности лизоцима от его концентрации.
2.0
о
Q 1.5 О
1.0
9
§ 0.5
-8 -7 -6 -5 -
Рис. 2. Изменение активности лизоцима с ростом концентрации 8В8 - кривые, рассчитанные по уравнению (2). Концентрация лизоцима 0.01 г/л (открытые символы) и 0.1 г/л (темные символы). Пунктирные линии - активность лизоцима в отсутствие ПАВ.
лизоцима в отсутствие ПАВ, составляющие для растворов с концентрацией 0.01 и 0.1 г/л (3.8 ± ± 0.6) х 10-4 OD/с и (1.24 ± 0.25) х 10-3 OD/с соответственно, отмечены на рисунках пунктирными линиями. Как видно из графиков, при концентрации лизоцима 0.01 г/л добавки как анионного, так и катионного ПАВ в области их малых концентраций приводят к росту скорости лизиса. Затем, при дальнейшем увеличении концентрации SDS свыше 5 х 10-5 М, а DTAB более 3 х х 10-6 М, активность снижается до величины, близкой к активности лизоцима в отсутствие ПАВ. При концентрации лизоцима 0.1 г/л оба ПАВ слабо влияют на скорость лизиса. Из полученных данных можно сделать вывод о том, что добавки SDS и DTAB в данных условиях не вызывают денатурацию лизоцима. Увеличение активности лизоцима в области малых концентраций добавленных SDS и DTAB
0
—6 lg [Surf]
Рис. 3. Изменение активности лизоцима с ростом концентрации ВТДБ — кривые, рассчитанные по уравнению (2). Концентрация лизоцима 0.01 г/л (открытые символы) и 0.1 г/л (темные символы). Пунктирные линии — активность лизоцима в отсутствие ПАВ.
может быть связано с особенностями взаимодействия компонентов смесей.
Для объяснения экспериментальных данных рассмотрим простую модель, где есть некий участок связывания ПАВ на белке, который можно охарактеризовать определенной константой десорбции (Kd1) для данного ПАВ. Допустим, что в случае связывания данным участком белка-фермента нескольких молекул ПАВ, К^ не меняется по мере заполнения его участка связывания (E(Surf)„_ . 1 + Surf о E(Surf)B). Средняя степень заполнения (доля заполнения) ПАВ данного участка связывания будет описываться функцией Q1 = [Surf]/(Kd1 + [Surf]), значение которой меняется от 0 до 1 ([Surf] — концентрация ПАВ). Значение Q1 = 0 соответствует состоянию E без связанного Surf, а Q1 = 1 соответствует состоянию E(Surf)B(maX), где я(шах) — максимальное число молекул Surf, которые могут связаться на данном участке белка. Вывод данного уравнения аналогичен выводу уравнения Ленгмюра для изотермы адсорбции. Допустим, что в первом приближении активность белка-фермента линейно меняется в зависимости от степени заполнения его данного контактного участка молекулами ПАВ. Получаем значение активности А = А0 + (А1 — A0)Q1, где A0 — активность белка-фермента в отсутствие ПАВ, а A1 — его активность при практически полном заполнении участка связывания ПАВ (приблизительно [Surf] > 20Kd1). Теперь допустим, что при более высоких значениях концентрации ПАВ начинается независимое заполнение еще одного участка связывания на этом же белке (E(Surf)„(max)(Surf)m — 1 + Surf о E(Surf)„(max)(Surf)m), которое характеризуется константой десорбции
Kd2. Если константа десорбции ПАВ для второго участка связывания с белком намного больше его константы для первого участка (например, Kd2 > > 50Kd1), то, рассуждая аналогично выше сказанному, для области концентраций ПАВ порядка величин значения Kd2 можем записать А = А1 + (А2 — A1)Q2, где А2 — активность белка-фермента после полного заполнения его второго участка связывания, а доля заполнения ПАВ второго участка связывания на белке-ферменте — Q2 = = [Surf]/(Kd2+[Surf]). Полное уравнение для всего диапазона концентраций ПАВ в случае двух разных участков связывания будет соответственно
A = A0 + (A1 — Ac)Q1 + (A2 — A1Q (1)
Подставляя зависимости Q1 и Q2 от [Surf], получаем:
A = Aо
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.