НЕЙРОХИМИЯ, 2004, том 21, № 1, с. 72-75
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 577.156
ВЛИЯНИЕ ПРЕНАТАЛЬНОГО СТРЕССА НА АКТИВНОСТЬ ОСНОВНЫХ КАРБОКСИПЕПТИДАЗ В ОТДЕЛАХ МОЗГА, НАДПОЧЕЧНИКАХ И ПОЛОВЫХ ЖЕЛЕЗАХ КРЫС
© 2004 г. Н. В. Балыкова, А. Н. Вернигора, Е. С. Мухина, М. Т. Генгин
Кафедра химии и биохимии Пензенского государственного педагогического университета им. В.Г. Белинского
Изучено влияние хронического эмоционально-болевого стресса матерей на активность карбокси-пептидазы Н и фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы у взрослого потомства. Обнаружены существенные половые различия в изменениях активности исследуемых кар-боксипептидаз у пренатально стрессированных животных. Пренатальный стресс, за исключением семенников, не влиял на активность ферментов у самцов, но оказывал существенное влияние на их активность у самок. У пренатально стрессированных самок активность карбоксипептидазы Н в гипофизе и гипоталамусе была выше, а в надпочечниках - ниже, чем у контрольных крыс. Активность ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы в гиппокампе и яичниках пренатально стрессированных самок была выше, а в больших полушариях - ниже, чем у контрольных животных. Обсуждается роль основных карбоксипептидаз в изменении функционального состояния гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой и центральной нервной систем у пренатально стрессированных животных.
Ключевые слова: карбоксипептидаза Н, ФМСФ-ингибируемая карбоксипептидаза, пренатальный стресс.
Стресс, перенесенный матерью во время беременности, оказывает существенное влияние на формирование адаптивных возможностей организма потомства, причем реакция на пренатальный стресс сильно зависит от пола [1]. Важная роль в ответе на стресс принадлежит биологически активным пептидам: адренокортикотропному гормону, кортикотропин-рилизинг фактору, Р-эндорфину, вазопрессину, энкефалинам, гонадот-ропным гормонам [2-4].
Указанные нейропептиды синтезируются в виде высокомолекулярных неактивных предшественников, которые активируются путем ограниченного расщепления пептидгидролазами [5]. В конечную стадию процессинга, в результате которой образуются биологически активные формы пептидов, вовлекаются основные карбоксипептидазы (экзопептидазы, отщепляющие остатки аргинина и лизина с С-конца пептидов), в частности карбоксипептидаза Н (КФ 3.4.17.10) [5] и фенилметилсульфонилфторид-ингибируемая карбоксипептидаза (ФМСФ-ингибируемая карбоксипептидаза) [6]. Показано, что эти ферменты вовлекаются в ответ на стресс [7]. Им принадлежит важная роль в формировании различий в уровне регуляторных пептидов у самцов и самок [8].
* Адресат для корреспонденции: 440028 Пенза, ул. Лермонтова, д. 37; факс (8412) 66-15-66; e-mail: mychina@mail.ru
Цель данной работы - изучение активности карбоксипептидазы Н и ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы в отделах мозга пренатально стрессированных самцов и самок крыс.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Опыты проводили на белых беспородных крысах обоего пола возрастом 120 дней. В эксперименте использовали две группы животных: пренатально стрессированную и контрольную. Животные пренатально стрессированной группы являлись потомством самок, которые в течение всего периода беременности раз в сутки в течение 20 мин подвергались эмоционально-болевому стрессу. Для этого животным через каждые 10 с в беспорядочном режиме подавали один из трех сигналов длительностью 1 с: вспышка света (лампа накаливания мощностью 100 Вт, расстояние 0.5 м), звук (110 дБ), электрокожное раздражение (сила тока 2 мА). В качестве контрольной группы использовали потомство интактных матерей.
Животных декапитировали и извлекали гипофиз, гипоталамус, стриатум, гиппокамп, четверохолмие, большие полушария, надпочечники и половые железы. Навески тканей гомогенизировали в 10 мМ натрий-ацетатном буфере, содержащем 50 мМ КаС1, рН 5.6, в соотношении 1 : 100 (вес : объем). Карбоксипептидазную активность определяли флюориметрическим мето-
Активность основных карбоксипептидаз в тканях пренатально стрессированных крыс (нмоль продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка, М ± 5.Е.М., п = 5-6)
Самцы Самки
Ткань
контроль стресс контроль стресс
Карбоксипептидаза Н
Гипофиз 2.61 ± 0.21 2.71 ± 0.38 1.33 ± 0.08+++ 2.72 ± 0.28***
Гипоталамус 0.75 ± 0.02 0.71 ± 0.04 0.55 ± 0.03+++ 0.68 ± 0.05*
Стриатум 0.44 ± 0.02 0.46 ± 0.05 0.46 ± 0.03 0.47 ± 0.04
Гиппокамп 0.65 ± 0.02 0.66 ± 0.05 0.52 ± 0.04++ 0.56 ± 0.08
Четверохолмие 0.88 ± 0.04 0.78 ± 0.05 0.63 ± 0.02+++ 0.64 ± 0.05
Большие полушария 0.50 ± 0.02 0.54 ± 0.03 0.49 ± 0.02 0.49 ± 0.04
Надпочечники 0.24 ± 0.02 0.20 ± 0.02 0.22 ± 0.01 0.16 ± 0.01**
Половые железы 0.35 ± 0.03 0.08 ± 0.01*** 0.19 ± 0.01+++ 0.17 ± 0.01+
ФМСФ-ингибируемая карбоксипептидаза
Гипофиз 1.22 ± 0.06 1.31 ± 0.12 1.33 ± 0.07 1.64 ± 0.15+
Гипоталамус 0.40 ± 0.04 0.42 ± 0.02 0.41 ± 0.03 0.43 ± 0.05
Стриатум 0.35 ± 0.03 0.38 ± 0.04 0.44 ± 0.03+ 0.37 ± 0.03
Гиппокамп 0.39 ± 0.03 0.43 ± 0.04 0.32 ± 0.03 0.41 ± 0.02*
Четверохолмие 0.41 ± 0.03 0.36 ± 0.03 0.41 ± 0.04 0.42 ± 0.02
Большие полушария 0.47 ± 0.04 0.41 ± 0.03 0.50 ± 0.01 0.40 ± 0.02***
Надпочечники 2.90 ± 0.25 2.52 ± 0.25 2.84 ± 0.17 2.87 ± 0.27
Половые железы 0.16 ± 0.02 0.24 ± 0.02 4.11 ± 0.30+++ 5.19 ± 0.40*' +++
*, **, *** Достоверные различия (р < 0.05,р < 0.01,р < 0.001 соответственно) между опытными и контрольными животными. +, ++, +++ Достоверные различия (р < 0.05, р < 0.01, р < 0.001 соответственно) между самцами и самками.
дом Fricker и Snyder [9]. Инкубационная смесь для определения активности состояла из 50 мкл гомо-гената и 150 мкл 50 мМ натрий-ацетатного буфера, содержащего 50 мМ NaCl, pH 5.6. Контрольные пробы в случае карбоксипептидазы H содержали высокоспецифичный ингибитор фермента гуанидиноэтилмеркаптоянтарную кислоту (1 мкМ), в случае ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы - ингибитор фермента фенилметилсульфо-нилфторид в конечной концентрации 1 мМ. Пробы преинкубировали 8 мин при 37°С, затем вносили 50 мкл предварительно нагретого до 37°С 210 мкМ раствора дансил-Phe-Ala-Arg (в случае карбоксипептидазы H) или дансил-Phe-Leu-Arg (в случае ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы), приготовленных на том же буфере, и инкубировали 60 мин при 37°С. Реакцию останавливали прибавлением 50 мкл 1 М HCl. Затем приливали по 1.5 мл хлороформа и встряхивали в течение 60 с. Хлороформную и водную фазы разделяли центрифугированием в течение 5 мин при 500 g. Флюоресценцию хлороформной фазы измеряли на флюориметре ФМЦ-2 при = 360 нм и = = 530 нм. Активность ферментов определяли как разность в накоплении продукта в опытных и
контрольных пробах и выражали в нмоль продукта (дансил-РИе-А1а в случае карбоксипептидазы Н и дансил-РИе-Ьеи в случае ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы), образовавшегося за 1 мин инкубации в расчете на 1 мг белка.
Белок определяли методом Лоури [10].
Достоверность различий между активностью ферментов определяли при помощи ^критерия Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
У животных контрольной группы обнаружены существенные половые отличия в активности исследуемых ферментов. Активность карбоксипептидазы Н в гипофизе, гипоталамусе, гиппо-кампе, четверохолмии и половых железах самок составляла 50-80% от таковой у самцов (таблица). Активность ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы в стриатуме самок была в 1.25 раза, а в половых железах почти в 26 раз выше, чем у самцов. Обнаруженные половые различия в активности основных карбоксипептидаз хорошо согласуются с описанными ранее [8] и, вероятно, связаны
74
БАЛЫКОВА и др.
с различиями в уровнях биологически активных пептидов у самцов и самок [3, 11].
Пренатальный стресс практически не влиял на активность исследуемых ферментов у самцов. Единственное исключение составила активность карбоксипептидазы Н в семенниках, в которых у пренатально стрессированных животных она была в 4 раза ниже, чем у контрольных (таблица).
У пренатально стрессированных самок активность карбоксипептидазы Н в гипофизе и гипоталамусе была выше, а в надпочечниках - ниже, чем у контрольных крыс. Стрессирование матерей не влияло на активность фермента в стриату-ме, гиппокампе, четверохолмии, больших полушариях и яичниках потомства.
Активность ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы в гиппокампе и яичниках пренатально стрессированных самок была выше, а в больших полушариях - ниже, чем у интактных животных. В остальных исследованных тканях пренатальный стресс не влиял на активность фермента.
Таким образом, во влиянии пренатального стресса на активность основных карбоксипепти-даз выявлены существенные половые различия. Так, стресс практически не влиял на активность ферментов у самцов, но вызывал значительные изменения активности карбоксипептидазы Н и ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы у самок. Известно, что в действии стресса на функционирование центральной нервной и гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой систем обнаруживаются существенные половые различия [3, 11, 12]. Он оказывает существенное, особенно выраженное у самок, влияние на уровень биологически активных пептидов, в особенности кор-тикотропина [3, 11, 13]. Обращает на себя внимание тот факт, что изменения активности карбоксипептидазы Н у пренатально стрессированных самок наблюдались в гипофизе, гипоталамусе и надпочечниках - отделах гипоталамо-гипофизар-но-надпочечниковой системы, которой принадлежит определяющая роль в ответе на стресс [1, 3]. Карбоксипептидаза Н участвует в процессинге предшественников кортикотропина, кортикотро-пин-рилизинг фактора и эндорфинов - пептидов гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы, регулирующих ответ на стресс [5]. Поэтому вероятно, что карбоксипептидазе Н принадлежит важная роль в изменении функционального состояния гипоталамо-гипофизарно-надпочечни-ковой системы при пренатальном стрессе. Вместе с тем, у самцов единственной тканью, в которой пренатальный стресс влиял на активность карбоксипептидазы Н, были семенники. Пренатальный стресс у самцов вызывает дегенеративные изменения в семенниках, в которых синтезируются энкефалины, вещество Р и другие биологичес-
ки активные
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.