НЕЙРОХИМИЯ, 2012, том 29, № 3, с. 240-246
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 612.8.015
ВЛИЯНИЕ ПРЕНАТАЛЬНОГО СТРЕССА НА ОКИСЛИТЕЛЬНУЮ МОДИФИКАЦИЮ БЕЛКОВ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС В ОНТОГЕНЕЗЕ
© 2012 г. А. В. Вьюшина*, А. В. Притворова, М. А. Флеров
Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН
Исследовали окислительную модификацию белков (ОМБ) в стриатуме, гиппокампе и гипоталамусе крыс различного возраста в норме и после пренатального стресса (ПС). Об изменении ОМБ судили по содержанию продуктов спонтанной ОМБ (СОМБ) и ОМБ, индуцированной реактивом Фентона (ФОМБ). Установлено, что процессы ОМБ в изученных отделах мозга характеризуются одинаковыми закономерностями. В норме наблюдается постепенное повышение содержания продуктов ОМБ с 10-го по 30-й день постнатального развития и снижение этих показателей у взрослых животных. При этом обнаруживаются различия в содержании продуктов ОМБ между отделами. У пренатально стрессированных животных динамика ОМБ во всех исследованных отделах значительно отличается. Уровень ОМБ у 10-и дневных крыс после ПС намного превышает значения у контрольных животных. Однако далее происходит снижение этих показателей как СОМБ, так и ФОМБ. Нарушения процессов ОМБ в стриатуме, гипоталамусе и гиппокампе под влиянием ПС могут быть одной из причин изменений адаптивного поведения у взрослых пренатально стрессированных животных.
Ключевые слова: окислительная модификация белков, головной мозг, пренатальный стресс, онтогенез, крыса.
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время значительное число клинических наблюдений и экспериментальных исследований, проведенных на животных, свидетельствуют о том, что стресс, перенесенный матерью на различных сроках беременности, оставляет патологический след в организме потомства после рождения. Одной из важнейших причин возникновения различных патологических состояний после пренатальных воздействий являются стойкие и необратимые изменения в нейроэндокринных системах организма [1—3]. Это выражается в повышении возбудимости, тревожности, изменении полового поведения [4].
Известно, что организм матери и плода образует единую функциональную систему мать—плацента—плод, обеспечивающую взаимосвязь двух организмов в форме генетически закодированных синхронизированных реакций. Важнейшим звеном, осуществляющим реализацию генетической программы развития, являются гормоны [5]. В ответ на стрессорные воздействия вовлекаются нейроэндокринные системы регуляции, гормоны стресса непосредственно воздействуют на геном развивающегося плода, вызывая нарушения гетерохронии в развитии различных структурных образований зародыша [6]. Следствием этого могут
* Адресат для корреспонденции: 199034 Санкт-Петербург, наб. Макарова, 6; 328-50-19 (доб. 110); e-mail: sts@infran.ru.
быть изменения физиологических функций ЦНС и как следствие физиологические и/или психические нарушения. В настоящее время известно, что особенность метаболизма мозга — интенсивный окислительный обмен [7], следствием которого является повышенная концентрация активных форм кислорода и продуктов их взаимодействия с биомолекулами. При этом активность антиокси-дантных ферментов мозга довольно низка [8, 9]. Данный парадокс связан с тем, что в процессе эволюции побочные продукты аэробного дыхания, обладающие рядом специфических свойств, нашли применение в регуляции функциональной активности головного мозга. Одно из центральных мест в работе сигнальных систем клетки принадлежит белкам и продуктам их метаболизма, в частности продуктам свободнорадикального окисления белков. Свободнорадикальное окисление белков можно рассматривать как систему внутренней модуляции и передачи информации как от внешней среды к внутриклеточным системам, так и наоборот. Следует отметить, что при сравнительном анализе свободнорадикального окисления белков и липидов [10] установлено, что белки в отличие от липидов реагируют на радикальную атаку раньше, чем липиды.
Вполне вероятно, что одним из возможных молекулярных механизмов реализации последствий ПС может быть свободнорадикальное окисление белков в структурах, осуществляющих нейроэндо-
кринный контроль высших интегративных функций — стриатуме, гиппокампе и гипоталамусе [11].
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Все эксперименты выполняли в соответствии с требованиями Директивы Совета Европейского Сообщества (86/60/9 ЕЕС) об использовании животных для экспериментальных исследований. Опыты проводили на крысах линии Вистар. Животные были приучены к ежедневному хэндлингу и взятию цитологических влагалищных мазков в течение предварительного акклиматизационного периода продолжительностью 1 мес. Для получения потомства молодых самок (п = 40) содержали по 5 особей в клетке при fC 18—22°С, световом режиме 12 : 12, свободном доступе к воде и сухому корму. В каждую клетку подсаживали по 2 самца той же линии. У самок, начиная со следующего дня после подсадки, ежедневно брали мазок из влагалища для определения фазы эстрального цикла и наличия сперматозоидов. Нулевым днем беременности считали день обнаружения сперматозоидов во влагалищном мазке. Всех беременных крыс разбивали на две группы — контрольную и опытную. Опытную группу (п = 20) подвергали иммобилизационному стрессу в узких пластиковых пеналах (20 х 7 х 6 см) по 1 ч в течение 4 дней — с 16-го по 19-й день беременности. Выбор сроков стрессирования обусловлен тем, что именно в этот период происходит интеграция всех звеньев ней-роэндокринной регуляции и завершается созревание гипоталамо-гипофизарно-адренокорти-кальной системы. Стресс беременных самок в этот период вызывает необратимые изменения в нейроэндокринных системах потомства (4.5). Самки второй группы (п = 20) оставались интакт-ными. За 1—2 дня до родов самок рассаживали в индивидуальные клетки. День рождения крысят считали нулевым днем жизни.
Выбор сроков исследования постнатального онтогенеза необходимо производить с учетом морфологических и возрастных характеристик этапов согласованного процесса биохимического и цитологического развития мозга.
Как известно, у крыс функциональное созревание нервной системы после рождения хорошо изучено и отличается довольно четкими метаболическими периодами. Одним из хорошо исследованных ключевых моментов постнатального развития нервной системы крысы является миелинизация. Изменения биохимических процессов в этот период могут в дальнейшем оказать влияние на формирование последствий пренатального стресса, таких как неврологические и когнитивные расстройства.
В связи с этим возраст исследуемых крыс был выбран с учетом биохимических преобразований в нервной системе в этот период. 10-дневные крыся-
та еще незрячие, процесс миелинизации только начинается. На 13—15-й день происходит открытие ушей, глаз, соответствено включение всех сенсорных систем ведет к бурному формированию новых функциональных систем и связей [12]. Пик интенсивного накопления белков миелина отмечается на 15-е—20-е дни [13]. К 30-м дням интенсивность формирования нейронных ансамблей и межструктурных связей снижается, масса головного мозга составляет 90% от массы мозга взрослого животного[12]. К 100 дням скорость роста и интеграции нервной, эндокринной и половой систем снижается и в дальнейшем изменяется незначительно по сравнению с первыми тремя месяцами жизни крысы [13]. Поэтому для исследования брали крыс в возрасте в 10, 20, 30 и 100 дней. Для того чтобы исключить влияние эстрального цикла на процессы свободнорадикального окисления, для исследования брали только самцов.
Определение окислительной модификации белков.
Контрольных и опытных животных умерщвляли мгновенной декапитацией, быстро извлекали на холоду головной мозг и выделяли отделы мозга: гиппокамп, стриатум, гипоталамус, после взвешивания определяли содержание продуктов ОМБ.
Для количественного определения был применен метод, основанный на реакции взаимодействия окисленных белков и 2,4-динитрофенилгидразина с образованием 2,4-динитрофенилгидразонов, которые регистрируют спектрофотометрически [14]. Перед определением продуктов ОМБ в пробах проводили осаждение нуклеиновых кислот, которые могут повышать уровень карбонильных соединений, реагирующих с 2,4-динитрофенилгид-разином, для чего использовали предварительную обработку тканевого гомогената стрептомицином. Результаты выражали в условных единицах (единицах экстинкции) в расчете на 1 мг белка.
Анализ предварительно проведенных экспериментов показал, что свободнорадикальное окисление белков с остатками полярных и неполярных аминокислот в изложенных условиях не различается. Поэтому в предлагаемой статье представлены данные по окислительной модификации белка на длине волны 363 нм. При определении ОМБ использовались два показателя: спонтанная ОМБ (СОМБ) и индуцированная реактивом Фентона ФОМБ. СОМБ является показателем, характеризующим уровень базальной ОМБ. ФОМБ — уровень приращения ОМБ после стимуляции реактивом Фентона — можно рассматривать как показатель наличия резервов субстрата для ОМБ. ФОМБ характеризует устойчивость системы к переокислению, индикатор стрессоустойчивости исследуемой ткани [15—17].
Достоверность различий между показателями рассчитывали с помощью критериев Краскелла— Уоллеса и Манна—Уитни.
Таблица 1. Содержание продуктов спонтанной ОМБ в стриатуме, гиппокампе и гипоталамусе контрольных крыс (Е/мг белка, М ± т, в скобках указано количество п)
Возраст Стриатум Гиппокам Гипоталамус
10 дней 0.046 ± 0.042 ± 0.048 ±
± 0.001 ± 0.005 ± 0.002
(6) (6) (6)
20 дней 0.178 ± 0.199 ± 0.278 ±
± 0.033 ± 0.027 ± 0.021
(7)* (7)* (8)*
30 дней 0.265 ± 0.205 ± 0.372 ±
± 0.009 ± 0.023 ± 0.031
(4)** (5) (5)**
100 дней 0.138 ± 0.126 ± 0.112 ±
± 0.027 ± 0.017 ± 0.024
(8)*** (9)*** (5)***
* — Р < 0.05 по сравнению с данными для 10 дней. ** — Р < 0.05 по сравнению с данными для 20 дней. *** — р < 0.05 по сравнению с данными для 30 дней.
Таблица 2. Содержание продуктов спонтанной ОМБ в стриатуме, гиппокампе и гипоталамусе пренатально стрессированных крыс (Е/мг белка, М ± т, в скобках указано количество п)
Возраст Стриатум Гиппокамп Гипоталамус
10 дней 0.121* ± 0.102* ± 0.103* ±
± 0.014 ± 0.012
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.