БИОФИЗИКА, 2015, том 60, вып. 1, с. 38-43
МОЛЕКУЛЯР НАЯ БИОФИЗИКА
УДК 577.32; 535.361
ВЛИЯНИЕ РАЗБАВЛЕНИЯ НА АГР ЕГАЦИЮ НАНОЧАСТИЦ ПОЛИКАРБОКСИЛЬНОГО ПРОИЗВОДНОГО ФУЛЛЕРЕНА С60
© 2015 г. А.Г. Бобылёв*, Н.В. Пеньков** ***, П.А. Трошин****, С.В. Гудков* *** *****
*Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290, Пущино Московской области, Институтская ул., 3; **Институт биофизики клетки РАН, 142290, Пущино Московской области,Институтская ул., 3; ***Пущинский государственный естественно-научный институт, 142290, Пущино Московской области, просп. Науки, 3;
****Институт проблем химической физики РАН, 142432, Черноголовка Московской области, ул. Академика C еменова, 1;
*****Институт общей физики им. А .М. Прохорова РАН, 119991, Москва, ул. Вавилова, 38
E-mail: bobylev7@rambler.ru
Поступила в p едакцию 11.06.14 г.
И сследовано влияние pазбавления на агрегацию наночастиц поликаpбокcильного пpоизводного фуллеpена Cgg. Показано, что при уменьшении его концешрации в водной фазе относительное количество ацетатов также уменьшается, а количество единичные молекул увеличивается, что потенциально может влиять на биологичеcкую активность соединения в пеpеcчете на одну молекулу. Добавление к производному фуллеpена pазличныx оpганичеcкиx и неоргани-чеcкиx солей пpиводит к интенсивной дезагрегации. Полученные данные позволяют пpедложить объяснение неcтеxиометpичеcкого xаpактеpа нейтpализации активныx фоpм киcлоpода производными фуллеpенов, а также по-новому оcмыcлить физичеcкий cмыcл pабот, поcвященныx воздействию наночастиц в cвеpxнизкиx концентpацияx на биологические объекты.
Ключевые слова: наночастицы, фуллерены, агрегация, динамическое светорассеяние.
К фуллеpенам, являющимcя молекуляpной фоpмой углеpода [1], пpоявляетcя значительный интеpеc во многиx облаcтяx иccледований, в том числе в cфеp е биомедицинcкиx пp иложений [2-4]. Наиболее изученным является фуллерен Сб0, молекулы которого состоят из 60 атомов углерода и представляют собой кар касные структуры, характеризующиеся наличием системы делокализованных п-электронов и сопряженных кр атных связей. Благодаря такой структур е фуллерен С60 и его производные могут легко реагировать с активными формами ки-слор ода (АФК). Химически немодифицирован-ные фуллерены и их водорастворимые производные проявляют выраженные антирадикальные свойства, что делает этот класс соединений потенциально привлекательным инструментом для регуляции свободнорадикальных процессов и уменьшения тяжести окислительного стресса в биологических системах [5]. Мощная антира-
Сокращения: АФК - активные формы кислорода, СОД -супероксиддисмутаза, ПКПФ-1 - поликарбоксильное производное фуллерена С60.
дикальная активность фуллеренов определяется электрон-дефицитными свойствами системы из 30 сопряженных кратных связей. Благодаря тому, что одна молекула Сб0 теоретически может дезактивировать десятки свободных радикалов, фуллерен получил название «губки для радикалов» [6]. Одним из наиболее интересных феноменов, связанных с антирадикальными свойствами фуллеренов, является нестехиометриче-ский механизм нейтрализации АФК. Суть данного феномена со стоит в следующем. П ри уменьшении концентрации фуллеренов в растворе активность каждой отдельно взятой молекулы возрастает. Так, в недавно опубликованной работе [7] показано, что производные фуллерена Сб0 являются миметиками суперок-сиддисмутазы (СОД). Установлено, что трис-малонатные аддукты фуллерена С60 способны дезактивировать супероксидные анион-радикалы в водных р аствор ах со скоростью, сравнимой со скоростью фермента С ОД. Так называемые «гидратированные фуллерены» взаимодействуют с гидроксильными радикалами, индуцированными ионизирующей радиацией, по
такому же нестехиометр ическому механизму [8]. Аналогичные данные есть и по нейтр ализации фуллеренами синглетного кислорода [9].
Известно, что подавляющее количество фуллер енов C60 и их производных существуют в водных растворах как в виде одиночных молекул, так и в виде агр егатов. Наиболее пр о -стым объяснением увеличения активности каждой отдельно взятой молекулы фуллер ена пр и уменьшении концентр ации пр епар ата является увеличение фр акции единичных молекул относительно фр акции агр егир ованных молекул пр и р азведении. Это пр иводит к увеличению сум -мар ных площадей контакта фуллер енов с жидкой фазой и к увеличению количества до ступ-ных р еакционно-способных групп фуллер енов в р аствор е. Однако в одной из пер вых р абот по этой тематике установлено, что п р и умень -шении концентр ации фуллер ена, модифицир о -ванного циклодекстрином, в растворе наблюдается его более интенсивная агрегация [10]. Полученные результаты объяснялись автор ами как взаимодействие «подобного с подобным» (уменьшением энер гии пр и гидр офобных взаимодействиях). Дальнейшее исследование вопр о -са о нестехиометр ическом механизме антир а -дикального действия фуллер енов пр ивело к появлению р азличных гипотез, суть котор ых за -ключается в том, что фуллер ены в водных р а створах создают вокруг себя некоторые уникальные стр уктур ы из молекул воды [8,9,11-13]. К сожалению, современный уровень развития техники не позволяет экспериментально под-твер дить или опр овер гнуть эти гипотезы.
В данной статье с помощью метода динамического свето р ассеяния исследовано влияние концентрации поликарбоксильного производного фуллер ена C60 (ПКПФ-1) на степень его агр егации в водных р аствор ах. Показано, что пр и уменьшении концентр ации пр епар ата пр о -исходит увеличение фракции единичных молекул относительно фр акции агр егир ованных. В целом, пр едставленные в статье данные объясняют пр едложенный р анее нестехиометр ический механизм антирадикальной активности фулле-ренов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использованы следующие реакти -вы: NaCl (ACS Grade, АррНСИеш, Гер мания), NaHCO3, ^2НР04-2Н 2О (ACS Grade, Amreso, CША), натрий лимоннокислый 3-замещенный, сукцинат натр ия, ацетат натр ия, NaN03, NaN02, Na2S04 (ACS Grade, Sigma-Aldrkh, CША). Поликарбоксильное производное фуллер ена получено по р анее описанным методи-
P ис. 1. Структур ная фор мула поликар боксильного пр оизводного фуллер ена ПКПФ-1.
кам [14,15]. Химическая формула ПКПФ-1 -C60(C6H4(CH2)3COOK)5Cl, молекуляр ный вес -1762,61 г/моль (рис. 1). Деионизованная вода была получена на установке Milli-Q (Millipore Corporation, CША) и имела рН 7,0 и удельное сопр отивление 18,2 МОмсм.
Измерение размеров частиц проводили методом динамического светорассеяния на приборе ZetaSizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd., Великобритания). Все измерения выполняли пр и темпер атур е 25,0±0,1°C. Анализир уе-мые суспензии помещали в полистирольную кювету и облучали лазер ом (длина волны 632,8 нм, мощность излучения не более 4 мВт). Измер яли интенсивно сть ра ссеянного на ча стицах излучения под углом 173° относительно напр ав-ления падающего луча с помощью лавинного фотодиода. Cигнал с фотодиода поступал на коррелометр, котор ый стр оил вр еменную автокорреляционную функцию флуктуаций интенсивности G(t):
G(t) = T J/(t)I(t - r)dt,
T
(1)
0
где I(t) - pегистрируемая интенсивность лазерного излучения в момент времени t, I - среднее значение интенсивности за время Т, т - время задер жки.
Корреляционная функция уср едняла сь по 15 циклам, в каждом из котор ы x вр емя накопления составляло 15 с. C помощью программного обеспечения ZetaSizer Nano ZS полученную корреляционную функцию разлагали по набору экспонент, у котор ы x хар актер ные вр емена за -тухания однозначно связаны с коэффициентами диффузии D• частиц в суспензии:
Размер, нм
Рис. 2. Распределение частиц производного фуллерена ПКПФ-1 в водной фазе по размерам при разных концентрациях (М, п = 5). Шкала абсцисс представлена в логарифмическом виде. Концентрация фуллерена: 1 - 0,09 мг/мл, 2 - 0,28 мг/мл, 3 - 0,83 мг/мл, 4 - 2,5 мг/мл, 5 - 8,3 мг/мл, 6-25 мг/мл.
/ОД - 1 = Х^ехр( - Ч2^{1),
(2)
РЕЗУЛЬТАТЫ
д =
4пп .
--81И
лп
Го}
2
V /
где ^0 - длина волны лазерного излучения в вакууме, п - коэффициент преломления среды (1,33), 9 - угол рассеяния, {Б1} - набор коэффициентов диффузии, по которым проводили разложение корреляционной функции, А. - величина, отражающая долю частиц с коэффициентом диффузии Б.
Каждому значению коэффициента диффузии Б, при известных значениях температуры Т и вязкости п ср еды, соответствует гидродинамический радиус г. частиц (соотношение Стокса-Эйнштейна):
г. = кТ / 6ппБ ..
(3)
Найденные наборы значений {А.} и {г.} определяют распр еделение исследуемых частиц по размерам.
Обработка данных. Данные представлены как средние значения (М) и их стандартные ошибки (т). Статистическую достоверность определяли с использованием метода ЛКОУЛ с последующей коррекцией с помощью теста Ньюмана-Кеулса и г-кр итерия Стьюдента.
На рис. 2 представлены результаты исследования влияния р астворения фуллерена ПКПФ-1 на распределение частиц по размерам в водной фазе методом динамического светорассеяния. Показано, что при растворении фул-лерена в деионизованной воде в концентрациях от 0,09 до 25 мг/мл наблюдаются две выраженные размерные фракции частиц. Первая размерная фр акция (Я^) частиц имеет ср едний радиус около 4 нм и представлена по большей части единичными молекулами фуллерена. К этой фракции мы относим все объекты, имеющие размер от 0,8 до 20 нм. Вто рая фр акция частиц (Я^) имеет ср едний радиус около 150 нм и представлена агрегатами молекул фуллерена. К этой фракции мы относим объекты, имеющие размер от 20 до 1100 нм. Ширина пика К пр и растворении фуллерена в концентрации 25 мг/мл составляет 8,0 нм; 8,3 мг/мл - 5,0 нм; 2,5 мг/мл - 3,8 нм; 0,83 мг/мл - 3,6 нм; 0,28 мг/мл - 3,2 нм; 0,09 мг/мл - 3,0 нм. То есть полуширина пика К с понижением концентрации уменьшается. Также с изменением концентрации фуллеренов изменяется соотношение вкладов каждой размерной фракции (К и Я2) в распределение по размерам. Вклад каждой размерной фр акции определяется удельной интенсивностью светорассеяния (/% - вклад первой размерной фракции (И1) в общее светорассеяние, /% - вклад второй фракции (Я2),
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.